Esami e procedure diagnostiche

La rapidità del processo di identificazione e isolamento delle persone infette è cruciale. La diagnosi viene effettuata utilizzando le caratteristiche cliniche, di laboratorio e radiologiche. Poiché i sintomi e i reperti radiologici della COVID-19 non sono specifici, l’infezione da SARS-CoV-2 deve essere confermata dalla reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR), amplificando una specifica sequenza genetica nel virus. Entro pochi giorni dalla pubblicazione dei primi casi, è stata definita una procedura diagnostica validata per SARS-CoV-2 (Corman 2020), a dimostrazione dell’enorme capacità di risposta ottenuta attraverso il coordinamento di laboratori accademici e pubblici nelle reti di ricerca nazionali ed europee.

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Esistono delle linee guida ad interim per la diagnosi di laboratorio dei casi sospetti di malattia da coronavirus (COVID-19), pubblicate dall’OMS il 19 marzo 2020 (WHO 2020). Recentemente sono state pubblicate diverse revisioni aggiornate e complete delle tecniche di laboratorio nella diagnosi di SARS CoV-2 (Chen 2020, Loffelholz 2020).

In contesti con risorse limitate, nessuna capacità diagnostica deve essere sprecata. È importante sottolineare che i pazienti devono essere sottoposti al test solo se un risultato positivo si traduce in un’azione necessaria. Non è questo il caso nei seguenti esempi:

  • Persone giovani che hanno avuto contatti con una persona infetta qualche giorno prima, che hanno sintomi lievi o moderati e che vivono da sole non hanno bisogno di test PCR, anche se hanno la febbre. Devono restare in quarantena domestica, o in congedo per malattia se necessario, almeno per 14 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi. Un test può essere utile solo per chiarire se possono lavorare in ospedale o in altre strutture sanitarie dopo la quarantena. Alcune autorità sanitarie richiedono almeno un test negativo (rinofaringeo) prima di ricominciare a lavorare (oltre ad almeno 48 ore in assenza di sintomi).
  • Una coppia che ritorna da un luogo considerato un focolaio dell’epidemia e sente la gola leggermente irritata. Di nuovo, dato che dovrebbero comunque rimanere in quarantena, il test non è necessario.
  • Una famiglia di quattro persone con tipici sintomi COVID-19. È sufficiente testare una sola persona (sintomatica). Se il test è positivo, non è necessario testare gli altri contatti domestici, purché rimangano a casa.

Queste decisioni non sono facili da comunicare, in particolare a pazienti spaventati e preoccupati.


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In altre situazioni, tuttavia, un test deve essere immediatamente eseguito e ripetuto se necessario, soprattutto per il personale medico con sintomi, ma anche, ad esempio, nelle case di cura per lungodegenti, al fine di identificare un possibile focolaio il più rapidamente possibile.

Anche se ci sono raccomandazioni costantemente aggiornate da parte delle autorità e delle istituzioni del sistema sanitario del paese su chi debba essere testato da chi e quando, essendo queste in costante evoluzione, devono essere continuamente adattate alla situazione epidemiologica locale. Con la riduzione dei tassi di infezione e l’aumento delle capacità di eseguire i test, un numero maggiore di pazienti sarà sicuramente in grado di essere esaminato in futuro e le indicazioni per eseguire un test potranno essere ampliate.

Raccolta dei campioni

Il SARS-CoV-2 può essere rilevato in diversi tessuti e fluidi corporei. In uno studio su 1.070 campioni raccolti da 205 pazienti con COVID-19, i campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare hanno mostrato i più alti tassi positivi (14 su 15; 93%), seguiti dall’espettorato (72 di 104; 72%), tamponi nasali (5 di 8; 63%), biopsia broncoscopica mediante raschiamento (6 su 13; 46%), tamponi faringei (126 su 398; 32%), feci (44 su 153; 29%) e sangue (3 su 307; 1%). Nessuno dei 72 campioni di urina è risultato positivo (Wang 2020).

Il virus non è stato individuato nel fluido vaginale di 10 donne con COVID-19 (Saito 2020). Inoltre, non è stato trovato nello sperma e nel latte materno (Song 2020, Scorzolini 2020). Tuttavia, in un caso pubblicato recentemente, l’RNA di SARS-CoV-2 è stato rilevato in campioni di latte materno di una madre infetta per 4 giorni consecutivi. La rilevazione dell’RNA virale nel latte ha coinciso con dei lievi sintomi di COVID-19 e con un test diagnostico positivo al SARS-CoV-2 del neonato (Groß 2020). In rare occasioni, il virus può essere presente anche nelle lacrime e nelle secrezioni congiuntivali (Xia 2020).

Oltre ai tamponi rinofaringei, i campioni possono anche essere ottenuti dall’espettorato (se prodotto), aspirato endotracheale o dal lavaggio broncoalveolare. È probabile che i test su campioni del tratto respiratorio inferiore siano più sensibili dei tamponi rinofaringei. Soprattutto nei pazienti gravemente malati, il virus è spesso più presente nelle vie respiratorie inferiori che in quelle superiori (Huang 2020). Tuttavia, con queste procedure esiste sempre un elevato rischio di “aerosolizzazione” e quindi il rischio maggiore di infezione nel personale curante.

In ogni caso, contrariamente al SARS-CoV, la replicazione virale di SARS-CoV-2 è molto alta nei tessuti del tratto respiratorio superiore, (Wolfel 2020). Secondo l’OMS, in pazienti ambulatoriali il materiale respiratorio per la PCR dovrebbe essere ottenuto da campioni prelevati dal tratto respiratorio superiore (tampone o lavaggio rinofaringeo e orofaringeo) (WHO 2020).  È preferibile raccogliere campioni sia da tamponi rinofaringei che orofaringei, che possono essere inseriti nella stessa provetta.

Tamponi rinofaringei – problemi pratici

È importante eseguire correttamente il tampone. L’esecuzione di tamponi nasofaringei ed orofaringei presenta numerose possibilità di errore che possono portare a risultati falsi negativi. Inoltre, devono essere prese misure di protezione per non mettere in pericolo l’esaminatore. Ogni tampone comporta un alto rischio di infezione! Sono necessari una protezione respiratoria, occhiali protettivi, camice e guanti. Deve essere praticata una corretta vestizione e rimozione degli indumenti protettivi! Molti errori si verificano quando viene rimossa una mascherina protettiva. E’ disponibile un video molto utile sulla preparazione, attrezzatura, procedura, gestione dei campioni, rimozione dei dispositivi di protezione individuale, ecc. nell’esecuzione dei tamponi (Marty 2020).

La procedura richiede che il paziente si sieda su una sedia e pieghi la testa leggermente all’indietro. L’esaminatore dovrebbe trovarsi in una posizione lievemente sfalsata, non immediatamente frontale, al fine di evitare un possibile espettorato da colpo di tosse. Si deve informare il paziente dell’eventuale breve disagio durante l’esame. Dovrebbero essere utilizzati tamponi idonei per il rilevamento di virus, il cui bastoncino dimostri una discreta flessibilità. I bastoncini di legno possono inattivare i virus e comportare un alto rischio di lesioni. Il tampone deve essere tenuto tra il pollice e l’indice, come una matita, in modo che l’estremità non tocchi nulla. La parete posteriore del rinofaringe viene generalmente raggiunta inserendo il tampone per 5-7 cm; raggiungendola è possibile percepire una leggera resistenza. Si deve evitare il contatto del tampone con i denti o la lingua durante la procedura; il tampone deve essere raccolto dalla parete posteriore del rinofaringe, direttamente accanto all’ugola. Attenzione al riflesso faringeo! Esistono molti video pratici su Internet per la corretta esecuzione dei tamponi. Dopo un’adeguata formazione, molti pazienti possono eseguire autonomamente i loro tamponi.

È possibile organizzare un sistema per effettuare indipendentemente i tamponi a domicilio per i pazienti che sono in grado di farlo (la maggior parte di essi). Un corriere recapita le provette direttamente a casa del paziente e le lascia davanti alla porta, evitando un contatto diretto tra paziente e corriere. Effettuato il tampone, le provette non devono essere toccate dal corriere (possono essere inserite direttamente in una busta o raccolte con una busta rovesciata) e devono essere consegnate direttamente al laboratorio (nessuna spedizione!). Questo procedimento richiede istruzioni chiare e precise, ma si è generalmente dimostrato realizzabile.

I tamponi possono essere conservati asciutti o in una piccola quantità di soluzione di NaCl; se necessario, questo particolare dovrebbe essere preventivamente chiarito con il laboratorio. Un referto rapido della PCR è importante e, se possibile, dovrebbe essere ottenuto preferibilmente entro lo stesso giorno della procedura. Bisogna fare attenzione all’esposizione al calore. In un piccolo studio, i campioni sono stati inattivati ​​da una incubazione a bagnomaria a 56° C per 30 minuti. 7/15 campioni con bassi valori virali si sono convertiti in falso negativo. Anche una conservazione prolungata ha portato a risultati falsi negativi (Pan 2020).

I campioni prelevati dai tratti respiratori inferiori possono includere espettorato (se prodotto) e/o aspirato endotracheale o lavaggio broncoalveolare nei pazienti con patologie respiratorie più gravi. Tuttavia, è necessario considerare l’elevato rischio di produzione di aerosol (attenersi rigorosamente alle procedure di prevenzione e controllo delle infezioni). Si possono anche raccogliere altri campioni clinici visto che il virus della COVID-19 stato rilevato nel sangue e nelle feci (vedi sotto).

La raccolta di campioni da tamponi orali o nasofaringei può causare disagio ai pazienti e mettere a rischio gli operatori sanitari. Contrariamente a molti virus respiratori, il SARS-CoV-2 è presente nella saliva e numerosi studi hanno dimostrato che la raccolta di campioni di saliva orofaringea posteriore (in profondità nella gola) sono possibili e più graditi sia dai pazienti sia per gli operatori sanitari (To 2020, Yu 2020). I campioni da gargarismi possono essere utilizzati per il monitoraggio, grazie alla loro non-invasività ed affidabilità. Il gargarismo si può ottenere chiedendo ai pazienti di far gorgogliare sulla parete faringea posteriore 20 ml di una soluzione salina normale sterile. Dopo 5-10 secondi, il paziente può espettorare la soluzione salina dalla gola in un contenitore sterile. In 24 campioni di gargarismi e tamponi rinofaringei esaminati in parallelo, il tasso di positività al test del gargarismo era molto più elevato di quello dei tamponi (Guo 2020).

Diffusione per via fecale

Sebbene non siano stati ancora segnalati casi di trasmissione per via oro-fecale, vi sono prove crescenti che SARS-CoV-2 si replichi attivamente nel tratto gastrointestinale. Vari studi hanno mostrato la presenza prolungata di RNA virale di SARS-COV-2 in campion id feci. (Chen 2020, Wu 2020).  Combinando i risultati di 26 studi, una rapida analisi ha rivelato che il 54% di dei pazienti testati per l’RNA fecale erano positivi. La durata della diffusione virale fecale variava da 1 a 33 giorni dopo un tampone rinofaringeo negativo (Gupta 2020).

Questi studi hanno sollevato dei dubbi sul fatto che i pazienti con tamponi faringei negativi siano veramente privi di virus, e se non sia quindi necessario il campionamento di ulteriori siti corporei. Tuttavia, la rilevanza clinica di questi risultati rimane poco chiara e vi è uno studio che non ha rilevato la presenza di virus infettivi in campioni di feci, nonostante le elevate concentrazioni di RNA virale (Wolfel 2020). Pertanto, la presenza del solo acido nucleico non può essere considerata sufficiente per definire il potenziale di diffusione virale o di infezione (Atkinson 2020). Per molte malattie virali, tra cui SARS-CoV o MERS-CoV, è noto che l’RNA virale può essere rilevato molto tempo dopo la scomparsa del virus infettivo.

Sangue

Il SARS-CoV-2 viene raramente rilevato nel sangue (Wang 2020, Wolfel 2020). Ma che dire del rischio di trasmissione associato alle trasfusioni? In uno studio di screening su 7.425 donazioni di sangue a Wuhan, solo 2 campioni di plasma da donatori asintomatici sono stati trovati positivi per l’RNA virale (Chang 2020).

Un altro studio coreano ha trovato sette donatori di sangue asintomatici e successivamente confermati postivi per COVID-19. Nessuno dei 9 pazienti trasfusi con le loro piastrine o globuli rossi è risultato positivo all’RNA SARS-CoV-2. La trasmissione per via trasfusionale di SARS-CoV-2 è stata considerata improbabile (Kwon 2020). Come per le feci, non è chiaro se la presenza di RNA rilevabile nel sangue indichi una capacità di infettare.

PCR

Sono disponibili diversi kit diagnostici basati su qPCR poiché i laboratori di tutto il mondo hanno personalizzato i propri test PCR per SARS-CoV-2 utilizzando primer diversi destinati a sezioni diverse della sequenza genetica del virus. Un’analisi dei diversi test e dispositivi diagnostici è stata pubblicata recentemente (Loffelholz 2020). Un protocollo per i test PCR in tempo reale (RT-PCR) per l’individuazione di SARS-CoV-2 con due target RdRp (IP2 e IP4) è  disponibile su https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2

Nuovi test RT-PCR mirati su RNA-polimerasi RNA-dipendente (RdRp)/elicasi, Spike e geni nucleocapsidi di SARS-CoV-2 possono essere utili per migliorare la diagnosi di laboratorio di COVID-19. Rispetto al saggio RdRp-P2 che viene utilizzato nella maggior parte dei laboratori europei, questi saggi non reagiscono in modo incrociato con SARS-CoV nelle colture cellulari e potrebbero essere più sensibili e specifici (Chan 2020).

In caso contrario, dato che i limiti di rilevabilità dei sei kit in commercio differiscono sostanzialmente (fino a una differenza di 16 volte), è possibile che i testi con limiti più bassi portino a risultati falsi negativi quando è utilizzata RT-PCR per diagnosticare l’infezione da SARS-CoV-2 (Wang 2020). Secondo gli autori, i fornitori di kits dovrebbero analizzare i problemi esistenti sulla base dell’applicazione clinica e migliorare ulteriormente i loro prodotti.

PCR qualitativa

Una PCR qualitativa (“risultato positivo o negativo”) è di solito sufficiente nella diagnostica di routine. La quantificazione dell’RNA virale è attualmente (per il momento) solo di interesse accademico. I risultati falsi positivi sono rari ma possono verificarsi. Sebbene la specificità analitica di questi test sia generalmente del 100%, la specificità clinica è inferiore, a causa di una possibile contaminazione (un problema rilevante per le procedure NAT (Nucleic Acid Testing) e/o da un errore umano nella gestione di campioni o dei dati (molto difficile da eliminare completamente). Come si è visto con la sierologia (vedi sotto), questi risultati falsi positivi avranno effetti da sostanziali a importanti in presenza di una prevalenza bassa (Andrew Cohen, comunicazione personale).

Un altro problema di comune a qualsiasi PCR qualitativa sono i risultati falsi negativi che possono avere molte cause. I tamponi raccolti in modo errato sono particolarmente comuni, ma si possono verificare anche errori in laboratorio.

In una analisi di 7 studi con un totale di 1.330 campioni respiratori, gli autori hanno stimato il tasso di falsi negativi di RT-PCR a seconda dei giorni dall’infezione. Nei 4 giorni precedenti l’insorgenza dei sintomi, la percentuale è diminuita dal 100% al 67%. Il giorno di insorgenza dei sintomi (giorno 5), la percentuale era del 38%, ed è poi diminuita al 20% (giorno 8) per poi riprendere ad aumentare dal 21% (giorno 9) al 66% (giorno 21). Se il sospetto clinico è elevato, l’infezione non deve essere esclusa sulla base della sola RT-PCR. La percentuale di falsi negativi è più bassa 3 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi o circa 8 giorni dopo l’esposizione (Kucirka 2020). La Figura 1 illustra la rilevazione di positività alla PCR e di anticorpi durante l’infezione da SARS-COV-2.

Diversi studi hanno mostrato come anche i pazienti asintomatici siano positivi al test PCR e possano trasmettere il virus (Bai 2020, Cereda 2020, Rothe 2020). La diffusione virale può iniziare da 2 a 3 giorni prima della comparsa dei primi sintomi. Analizzando un totale di 414 tamponi faringei in 94 pazienti, la più alta carica virale nei tamponi è stata rilevata al momento dell’insorgenza dei sintomi. L’infettività è iniziata 2,3 giorni (IC al 95%, 0,8-3,0 giorni) prima dell’inizio dei sintomi e ha raggiunto il picco 0,7 giorni prima dei sintomi (He 2020). Si è stimato che l’infettività si riduca poi rapidamente entro sette giorni.

 

Figura 1. Cronologia dei marker diagnostici per il rilevamento di SARS-CoV-2.  AB = Anticorpo.

 

In una coorte di 113 pazienti sintomatici, la durata media della rilevazione dell’RNA del SARS-CoV-2 è stata di 17 giorni (differenza interquartile 13-22 giorni) misurata a partire dall’insorgenza della malattia. In alcuni pazienti, la PCR è stata positiva anche più a lungo: il sesso maschile e la gravità della malattia (necessità di ventilazione meccanica invasiva) sono considerati fattori di rischio indipendenti per una diffusione virale prolungata (Xu 2020).

Recenti segnalazioni di pazienti che mostrano risultati positivi dopo ripetute PCR negative e la guarigione clinica hanno attirato molta attenzione mediatica, (Lan 2020, Xiao AT 2020, Yuan 2020). Questi studi sollevano la questione della possibile riattivazione o di una nuova infezione con COVID-19 (vedi sotto, capitolo clinico). Per ora, è molto più probabile che questi risultati siano dovuti a problemi metodologici (Li 2020). A bassi livelli virali, specialmente durante gli ultimi giorni di un’infezione, la carica virale può fluttuare ed essere a volte rilevabile e altre volte no (Wolfel 2020). La riattivazione, e anche una rapida reinfezione, sarebbero molto insolite per un coronavirus.

Quantificazione della carica virale

Diversi studi hanno valutato la carica virale SARS-CoV-2 in differenti campioni. In un piccolo studio prospettico, la carica virale nei tamponi oro/naso/faringei raccolti da 17 pazienti sintomatici è stata analizzata in relazione al giorno di insorgenza di un qualsiasi sintomo (Zou 2020). È da notare che la carica virale rilevata nei pazienti asintomatici era simile a quella nei pazienti sintomatici, il che conferma la possibilità di trasmissione da pazienti asintomatici o minimamente sintomatici.

In un altro studio su 82 individui infettati, le cariche virali nei campioni di tampone faringeo e nell’espettorato hanno raggiunto il picco circa 5-6 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi, variando da circa 79.900 copie/ml nel tampone a 752.000 copie per ml nell’espettorato (Pan 2020). In uno studio sui campioni di saliva orofaringea, i pazienti con COVID-19, a differenza della SARS, presentavano la più alta carica virale già durante la manifestazione dei primi sintomi, il che potrebbe spiegare la rapida diffusione di questa epidemia (To 2020). In questo studio, la carica virale media nella saliva orofaringea posteriore o in altri campioni respiratori era di 5,2 log10 copie per ml (IQR 4.1-7.0).  In un totale di 323 campioni di 76 pazienti, la carica virale media nell’espettorato (17.429 copie/test) era significativamente più elevata rispetto ai tamponi faringei (2.552 copie) e ai tamponi nasali (651 copie). La carica virale era più alta nelle fasi iniziali e progressive rispetto alla fase di remissione (Yu 2020). Secondo uno studio pubblicato di recente, la diffusione virale potrebbe già iniziare 2-3 giorni prima della comparsa dei primi sintomi e il profilo di infettività potrebbe assomigliare più a quello dell’influenza che alla SARS (He 2020).

Cariche virali più elevate potrebbero essere associate a esiti clinici più gravi. In uno studio che ha valutato campioni seriali di 21 casi lievi e 10 casi gravi (Liu 2020), si è visto che i casi lievi hanno una clearance virale precoce, con il 90% di questi pazienti che presentavano test RT-PCR negativi ripetuti entro il decimo giorno dall’insorgenza dei sintomi. Al contrario, tutti i casi gravi sono risultati ancora positivi al decimo giorno all’esordio e successivamente. Tuttavia, sono necessari ampi studi prospettici per poter valutare il possibile ruolo della carica virale SARS-CoV-2 come marker per la valutazione della gravità e della prognosi della malattia.

Dovremmo misurare la carica virale? Probabilmente sì. Può essere utile nella pratica clinica. Un risultato positivo di RT-qPCR potrebbe non significare necessariamente che la persona è ancora infettiva o che ha ancora una malattia significativa. L’RNA potrebbe provenire da virus non vitali e/o la quantità di virus vitale potrebbe essere troppo bassa per la trasmissione. RT-qPCR fornisce la quantificazione eseguendo prima la trascrizione inversa dell’RNA nel DNA e quindi eseguendo la PCR quantitativa in cui un segnale di fluorescenza aumenta proporzionalmente alla quantità di acido nucleico amplificato. Il test è positivo se la fluorescenza raggiunge una soglia definita entro un certo numero di cicli PCR (valore Ct (ciclo soglia), inversamente proporzionale alla carica virale). Molti saggi qPCR utilizzano un limite cut-off del Ct di 40, consentendo il rilevamento di pochissime molecole di RNA di partenza. Alcuni esperti (Tom 2020) suggeriscono di utilizzare questo valore Ct o di calcolare la carica virale che può aiutare a perfezionare il processo decisionale (isolamento più breve, ecc.). Sfortunatamente, esiste ancora un’ampia eterogeneità e incoerenza delle curve standard calcolate da studi che hanno fornito valori di Ct da campioni di diluizione seriali e le cariche virali stimate. Secondo altri esperti, sono necessarie precauzioni nell’interpretazione i valori Ct dei risultati di SARS-CoV-2 RT-PCR che sono riportati nelle pubblicazioni sulla COVID-19 per evitare malintesi sulla cinetica della carica virale nel confrontare i diversi studi (Han 2020).

Sistemi di test diversi dalla PCR

Test diagnostici veloci

I test diagnostici veloci (point-of-care test) sono dispositivi di facile utilizzo per facilitare il test al di fuori dei laboratori di analisi. (Joung 2020). Sono attesi con impazienza. Il 6 maggio, la FDA ha concesso un’autorizzazione all’uso d’emergenza per un test fluorescente SARS-CoV-2 basato sulla tecnica CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) e commercializzato da Sherlock Biosciences. Questo metodo fornisce risultati in un’ora e ha diagnosticato con successo 12 pazienti positivi e 5 negativi in ​​COVID-19, con almeno 2 repliche su 3 positive nelle persone infette. Tuttavia, il suo utilizzo rimane ancora limitato ai laboratori certificati per eseguire test di elevata complessità. Il 6 maggio, la FDA ha anche autorizzato il test antigenico rapido di immunometria tramite fluorescenza Sofia 2 SARS della Quidel. Questo test deve essere letto su un analizzatore apposito e rileva la proteina nucleocapside SARS-CoV-2 dai tamponi rinofaringei in 15 minuti. Secondo il produttore, il test ha dimostrato una sensibilità clinica accettabile e ha rilevato 47/59 infezioni (80%). Sfortunatamente, ad oggi non sono stati pubblicati articoli scientifici con peer-review. Data la loro bassa sensibilità, questi test possono servire principalmente come uno strumento iniziale per identificare gli individui potenzialmente infettivi molto rapidamente, vale a dire nelle unità di emergenza. Non potranno essere usati come test diagnostici generali.

Diagnosi in situazioni di carenza di kit diagnostici PCR

Non vi è dubbio che l’obiettivo generale deve essere quello di identificare quante più infezioni possibili. Tuttavia, in molti paesi, una carenza di kit diagnostici non permette di soddisfare le necessità di una popolazione infetta in rapida crescita. Pertanto, campioni composti da pool aggregati vengono spesso utilizzati per risparmiare materiale diagnostico. Diversi campioni vengono esaminati insieme e solo quando un campione aggregato è positivo, i campioni verranno esaminati singolarmente.

Alcuni studi hanno anche esplorato la possibilità, se fosse necessario durante periodi ed in paesi con prevalenza elevata, di effettuare la diagnosi senza PCR. Un ampio studio retrospettivo caso-controllo a Singapore ha valutato i fattori predittivi di infezione da SARS-CoV-2, utilizzando elementi come il rischio di esposizione, variabili demografiche, la valutazione clinica e i risultati dei test clinici (Sun 2020). Anche in assenza di fattori di rischio dati dall’esposizione e/o evidenza radiologica di polmonite, i sintomi e i test clinici possono identificare soggetti ad alto rischio di COVID-19. Leucopenia, linfocitopenia, temperatura corporea elevata, frequenza respiratoria elevata, sintomi gastrointestinali e riduzione della produzione di espettorato erano strettamente associati a un test SARS-CoV-2 positivo. Tuttavia, questi modelli di previsione preliminare sono sensibili al contesto epidemiologico locale e alla fase dell’epidemia globale. Ha senso considerarli solo durante i periodi di elevata incidenza. In altre parole: se vedo un paziente durante il picco di un’epidemia, che presenta febbre, tosse, respiro corto e linfopenia, posso essere quasi sicuro che questo paziente soffra di COVID-19. Durante le fasi con minor incidenza di COVID-19, questi modelli non hanno senso. Non vi è dubbio che il test dell’acido nucleico o il sequenziamento genetico rappresentino i metodi standard per la conferma dell’infezione. Quando è disponibile la PCR, si deve eseguire la PCR.

Sierologia (test anticorpali)

L’identificazione di un’infezione virale pregressa tramite la ricerca di anticorpi prodotti da una persona infetta sarà uno degli obiettivi più importanti nella lotta contro la pandemia di COVID-19. Il test anticorpale ha molte finalità: questi test sierologici sono di fondamentale importanza per determinare la sieroprevalenza o un’esposizione precedente al virus, e per identificare donatori umani altamente reattivi per la raccolta di siero di convalescente per uso terapeutico. I test sierologici saranno inoltre utili per la tracciabilità dei contatti e per lo screening degli operatori sanitari al fine di identificare coloro che sono già immuni. Quante persone sono state realmente infettate? In quante persone il virus è sfuggito alla diagnosi di PCR e per quali motivi? Quanti pazienti sono asintomatici e qual è il tasso di mortalità reale in una popolazione definita? Solo con test sierologici completi (e ben pianificati studi epidemiologici) saremo in grado di rispondere a queste domande e chiarire i molti dati ancora sconosciuti nelle stime attuali. Diverse indagini sono già in corso in un’ampia varietà di luoghi in tutto il mondo.

Nelle ultime settimane è diventato chiaro che i test sierologici possono anche essere di aiuto come strumento diagnostico complementare per la COVID-19. La sieroconversione di specifici anticorpi IgM e IgG è stata osservata già dal quarto giorno dopo l’insorgenza dei sintomi. Gli anticorpi possono essere rilevati nelle fasi intermedie e successive della malattia (Guo L 2020, Xiao DAT 2020). Se una persona con una COVID-19 altamente sospetta rimane negativa ai test PCR e se i sintomi sono in atto da almeno diversi giorni, i test anticorpali possono essere utili e migliorare la sensibilità diagnostica.

Tuttavia, i test sugli anticorpi non sono semplici. Devono essere prese in considerazione l’eterogeneità molecolare dei sottotipi SARS-CoV-2, le prestazioni ancora imperfette dei test disponibili e la reattività crociata con i coronavirus stagionali (recensioni: Krammer 2020, Torres 2020).

Tests

Diversi gruppi di ricercatori stanno lavorando per produrre questi test (Amanat 2020), alcuni dei quali sono già disponibili in commercio. Krammer offre una buona panoramica generale delle diverse piattaforme, inclusi test di legame antigene-anticorpo come i test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay o saggio immuno-assorbente legato ad un enzima), i test a flusso laterale o i test Western Blot (Krammer 2020). Inoltre, test funzionali che misurano la neutralizzazione dei virus, test di inibizione enzimatica, o i test battericidi possono a loro volta fornire informazioni sulle risposte immunitarie mediate dagli anticorpi. Vengono inoltre discusse molte avvertenze e questioni ancora aperte in merito ai test anticorpali.

I test anticorpali si concentrano solitamente sugli antigeni (proteine). Nel caso di SARS-CoV-2, vengono utilizzati diversi kit ELISA basati sulla proteina nucleocapsidica ricombinante e sulla proteina Spike (Loffelholz 2020). La proteina Spike del SARS-CoV-2 sembra essere il bersaglio migliore. Tuttavia, decidere quale parte della proteina Spike usare è meno evidente e molto dipende dall’unicità della proteina Spike. Più è unica, minore è la probabilità di reattività crociata con altri coronavirus, e quindi minore anche quella di avere risultati falsi positivi derivanti da una immunità verso altri coronavirus. La reattività crociata con altri coronavirus può essere un vero problema. I cosiddetti test di conferma (di solito test di neutralizzazione) possono essere utili per ridurre i risultati falsi positivi.

Anche con una specificità molto elevata oltre il 99%, specialmente nelle aree a bassa prevalenza, il valore informativo del test è limitato e un alto tasso di risultati falsi positivi deve essere tenuto in considerazione. Per esempio: con una specificità del 99%, si può prevedere che un test su 100 sia falso positivo. Se la prevalenza è elevata, questo è meno rilevante. Tuttavia, se una persona viene sottoposta a test in una situazione di prevalenza bassa, la probabilità che un test positivo sia davvero positivo (il valore predittivo positivo, ovvero il numero di test realmente positivi diviso per il numero di tutti i test positivi) è basso. In una popolazione con una prevalenza dell’1%, il valore predittivo positivo sarebbe solo del 50%!  Le stime attuali dall’Islanda, una popolazione ben definita ma non selezionata, suggeriscono un tasso di positività relativamente costante di circa lo 0,8% a marzo 2020 (Gudbjartsson 2020). Anche nei paesi apparentemente colpiti più gravemente, i tassi di infezione sono solo leggermente più alti. Se ipotizziamo per la Germania, uno dei paesi con il maggior numero di casi di infezione al mondo, un numero di infezioni pari a 183.000 (30 maggio), e ipotizziamo che il numero di infezioni non diagnosticate sia circa 5 volte più elevato, allora la prevalenza in Germania è complessivamente ancora ferma ad un livello attorno all’1%. Se quasi una persona su cento è infetta, ogni due test positivi uno sarebbe un falso positivo anche con una specificità del 99%. Lo screening generalizzato degli anticorpi nella popolazione produrrà quindi un tasso abbastanza elevato di risultati falsi positivi.

La sensibilità e la specificità media dei test anticorpali approvati dalla FDA sono rispettivamente dell’84,9% e del 98,6%. Data la prevalenza variabile di COVID-19 (1% -15%) in diverse parti del mondo, statisticamente il valore predittivo positivo sarà compreso tra il 30% e il 50% nelle aree a bassa prevalenza (Mathur 2020).

Indicazione nella pratica clinica

Al di fuori degli studi clinici: chi dovrebbe fare il test anticorpale? Il test in realtà non ha senso per i pazienti con una malattia COVID-19 precedente e comprovata. Tuttavia, può ancora essere fatto se, ad esempio, si desidera convalidare un altro test diagnostico. Inoltre, in coloro che si occupano di assistenza sanitaria o lavorano in altre professioni ad alto rischio di trasmissione questi test possono essere utili al fine di identificare retrospettivamente possibili contatti a rischio. Tuttavia, dovremmo misure gli anticorpi solo quando il risultato del test ha delle implicazioni. I pazienti devono essere informati del basso valore predittivo positivo, specialmente in quelli senza alcuna evidenza precedente di malattia o di esposizione alla COVID-19. In questi pazienti, il test anticorpale non è raccomandato. Fuori dai focolai epidemiologici, praticamente tutti sono ancora sieronegativi e se il test risulta positivo, il suo valore predittivo è troppo basso.

Cinetica anticorpale

Le risposte sierologiche ai coronavirus sono solo transitorie. Gli anticorpi verso altri coronavirus umani stagionali possono scomparire dopo solo alcuni mesi. Dati preliminari suggeriscono che il profilo degli anticorpi contro SARS-CoV-2 è simile a SARS-CoV (Xiao DAT 2020). Per SARS-CoV, gli anticorpi non sono stati rilevati nei i primi 7 giorni di malattia, ma il titolo di IgG aumentava notevolmente al giorno 15, raggiungendo un picco al giorno 60, ed restava elevato fino al giorno 180, quando iniziava a diminuire gradualmente fino al giorno 720. Le IgM si evidenziavano al giorno 15 e raggiungevano rapidamente il picco, per poi diminuire gradualmente fino a livelli non rilevabili al giorno 180 (Mo 2006). Come con altri virus, gli anticorpi IgM si presentano un po’ prima degli anticorpi IgG che sono più specifici. Gli anticorpi IgA sono relativamente sensibili ma meno specifici (Okba 2020).

Il primo ampio studio sulla risposta umorale dell’ospite contro SARS-CoV-2 ha dimostrato che i test anticorpali possono essere utili nella diagnosi di COVID-19, compreso per i casi subclinici (Guo 2020). In questo studio, la risposta delle IgA, IgM e IgG è stata analizzata usando un test ELISA sulla proteina nucleocapsidica virale ricombinante in 208 campioni di plasma da 82 casi confermati e 58 probabili (Guo 2020). La durata media del rilevamento di anticorpi IgM e IgA è stata di 5 giorni (IQR 3-6), mentre le IgG sono state rilevate il 14esimo giorno (IQR 10-18) dopo l’insorgenza dei sintomi, con un tasso di positività rispettivamente dell’85,4%, 92,7% e 77,9%. L’efficacia della diagnosi IgM con ELISA era superiore a quella della PCR dopo 5,5 giorni dall’insorgenza dei sintomi. In un altro studio su 173 pazienti, i tassi di sieroconversione (tempo medio) per IgM e IgG erano rispettivamente dell’82,7% (12 giorni) e del 64,7% (14 giorni). Un titolo più elevato di anticorpi è stato associato in modo indipendente a forme più gravi della malattia (Zhao 2020).

In alcuni pazienti, le IgG si evidenziano più velocemente delle IgM. In uno studio sui modelli di sieroconversione degli anticorpi IgM e IgG, il momento di sieroconversione degli anticorpi IgG era precedente alle IgM. Gli anticorpi IgG hanno raggiunto la massima concentrazione il giorno 30, mentre gli anticorpi IgM hanno raggiunto il picco il giorno 18, per poi iniziare a diminuire (Qu J 2020). Il più grande studio completato fino ad oggi ha descritto le risposte anticorpali acute in 285 pazienti (per lo più con COVID-19 non grave). Entro 19 giorni dall’esordio dei sintomi, il 100% dei pazienti è risultato positivo alle IgG antivirali. La sieroconversione per IgG e IgM si è verificata contemporaneamente o in sequenza. Entrambi i titoli di IgG e IgM hanno raggiunto il plateau entro sei giorni dalla sieroconversione. Il giorno medio di sieroconversione sia per le IgG che per le IgM è stato 13 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi. Non è stata trovata alcuna associazione tra i livelli di IgG al plateau e le caratteristiche cliniche (Long 2020).

Tutti gli individui asintomatici sviluppano anticorpi? Probabilmente no. In cinque casi asintomatici, solo uno ha generato risposte anticorpali specifiche SARS-CoV-2 entro le prime 4 settimane (Yongchen 2020).

Nel complesso, il test anticorpale non è solo uno strumento epidemiologico e può anche essere utile nella diagnosi. Nei prossimi mesi si capirà meglio come la risposta anticorpale umana a SARS-CoV-2 possa mutare nel tempo e come questa risposta e i titoli anticorpali siano correlati con l’immunità. È anche ipotizzabile che in alcuni pazienti (ad esempio quelli con immunodeficienza), la risposta anticorpale rimanga ridotta.

Radiologia

Tomografia toracica computerizzata

La tomografia computerizzata (TC) può svolgere un ruolo importante sia nella diagnosi che nella valutazione della gravità e del follow-up della malattia. La TC toracica ha una sensibilità relativamente alta per la diagnosi di COVID-19 (Ai 2020, Fang 2020). Tuttavia, circa la metà dei pazienti può presentare una TC normale durante i primi 1-2 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi (Bernheim 2020). D’altra parte, è emerso chiaramente molto presto nel corso dell’attuale pandemia che una considerevole percentuale di pazienti subclinici potrebbe già avere reperti TC patologici in esami eseguiti prima dell’insorgenza dei sintomi (Chan 2020, Shi 2020). In alcuni di questi pazienti con reperti TC patologici con evidenza di polmonite, le PCR nei tamponi rinofaringei erano ancora negative (Xu 2020). D’altra parte, metà dei pazienti che successivamente sviluppano una polmonite morfologicamente visibile alla TC può ancora presentare una TC normale nei primi 1-2 giorni dopo la comparsa dei sintomi (Bernheim 2020).

Tuttavia, non si dovrebbe sopravvalutare il valore della TC toracica. La raccomandazione di alcuni ricercatori cinesi di includere la TC come elemento essenziale nella diagnosi di COVID-19 ha portato a dure critiche, in particolare da parte di esperti nei paesi occidentali. Negli studi cinesi si sono rilevati errori e carenze significative. Considerando l’impegno richiesto e anche il rischio di infezione per il personale, molti esperti rifiutano rigorosamente uno screening TC generalizzato nei pazienti con infezione o sospetto di infezione da SARS-CoV-2 (Hope 2020, Raptis 2020). Secondo la raccomandazione della British Radiology Society, che ha tentato di incorporare la TC negli algoritmi diagnostici per la COVID-19, il valore della TC resta da chiarire, anche quando la PCR è negativa o non disponibile (Nair 2020, Rodrigues 2020). Una TC toracica deve essere eseguita solo se si devono prendere in considerazione complicanze o diagnosi differenziali (Raptis 2020).

In studi in cieco, radiologi provenienti dalla Cina e dagli Stati Uniti hanno provato a differenziare la polmonite COVID-19 da altre polmoniti virali. La specificità era piuttosto elevata, la sensibilità molto più bassa (Bai 2020). Una recente meta-analisi ha riscontrato un’alta sensibilità ma una bassa specificità (Kim 2020). La sensibilità della TC è stata influenzata dalla distribuzione della gravità della malattia, dalla proporzione di pazienti con comorbidità, e dalla percentuale di pazienti asintomatici. Nelle aree a bassa prevalenza, la TC toracica aveva un basso valore predittivo positivo (1,5-30,7%).

Quando sono patologiche, le immagini di solito mostrano un coinvolgimento bilaterale, con più opacità a chiazze o a vetro smerigliato (GGO) a distribuzione sub-pleurale in più lobi bilaterali. Le lesioni possono presentare significative sovrapposizioni con quelle da SARS e MERS (Hosseiny 2020).

Un’analisi sistematica dei referti radiologici in 919 pazienti ha trovato come caratteristica più comune la GGO bilaterale multilobare con una distribuzione periferica o posteriore, principalmente nei lobi inferiori e meno frequentemente nel lobo medio destro (Salehi 2020). In questa analisi, la presentazione iniziale atipica di un’immagine di opacità consolidative sovrapposte a GGO è stata trovata in un numero inferiore di casi, principalmente nella popolazione anziana. L’ispessimento dei setti, bronchiectasie, ispessimento pleurico e coinvolgimento sub-pleurico erano meno frequenti, principalmente presenti nelle fasi avanzate della malattia. Versamento pleurico, versamento pericardico, linfoadenopatia, cavitazione, il segno dell’alone CT e pneumotorace erano rari (Salehi 2020).

L’evoluzione della malattia alla TC non è ancora chiarita. Tuttavia, con il passare del tempo dopo l’insorgenza dei sintomi, le lesioni presenti alla TC sono più frequenti e tra essi vi sono consolidamento, malattia bilaterale e periferica, maggiore coinvolgimento polmonare totale, opacità lineari, pattern di “pavimentazione folle” e segno “alone inverso” (Bernheim 2020). Alcuni esperti hanno proposto di suddividere i reperti radiologici in quattro fasi distinte (Li 2020). Nella fase iniziale, emergono piccole ombre multiple irregolari e modificazioni interstiziali. Nella fase progressiva, le lesioni aumentano e si allargano, sviluppandosi in GGO multiple e con consolidamento infiltrativo in entrambi i polmoni. Nella fase grave si osservano massicci consolidamenti polmonari e “polmoni bianchi”, ma il versamento pleurico è raro. Nella fase dissipativa, le GGO e i consolidamenti polmonari sono stati completamente riassorbiti e le lesioni hanno iniziato a trasformarsi in fibrosi.

In uno studio longitudinale che ha analizzato 366 scansioni TC seriali in 90 pazienti con polmonite da COVID-19, l’entità delle alterazioni polmonari è progredita rapidamente e ha raggiunto il picco durante i 6-11 giorni dall’inizio della malattia (Wang 2020). In questo studio, il quadro predominante delle alterazioni dopo l’insorgenza dei sintomi era l’opacità a vetro smerigliato (45-62%). Con il progredire della polmonite, le aree delle lesioni si allargano ed entro pochi giorni si sviluppano in consolidati diffusi in entrambi i polmoni (Guan 2020).

La maggior parte dei pazienti dimessi presentava lesioni residue nelle ultime immagini TC (Wang Y 2020). Sono necessari studi con un follow-up più lungo per valutare il reale danno polmonare permanente o a lungo termine, inclusa la fibrosi, come si è visto nelle infezioni da SARS e MERS. Si prevede che la fibrosi polmonare sia il principale fattore che possa portare ad una disfunzione polmonare e alla ridotta qualità della vita nei sopravvissuti alla COVID-19 dopo la guarigione. Sono necessarie ulteriori ricerche sulla correlazione dei risultati CT con la gravità clinica e la progressione della malattia, il valore predittivo della TC di base o delle modifiche nel tempo sull’esito della malattia, e le sequele del danno polmonare acuto indotto dalla COVID-19 (Lee 2020).

Da segnalare che la TC del torace non è raccomandata in tutti i pazienti con COVID-19, soprattutto in quelli che stanno sufficientemente bene da essere dimessi o in quelli con solo brevi periodi sintomatici (<2 giorni). In caso di COVID-19, un gran numero di pazienti con infezione o sospetta infezione si affollano in ospedale. Di conseguenza, il carico di lavoro sul dipartimento di radiologia aumenta notevolmente. Poiché la trasmissione di SARS-CoV-2 avviene attraverso goccioline respiratorie e il contatto ravvicinato, è necessario evitare esami TC non necessari. An et al. offrono una panoramica della prevenzione e del controllo dell’epidemia COVID-19 nel dipartimento di radiologia.

Ultrasuoni, PET ed altre tecniche diagnostiche

Alcuni esperti hanno ipotizzato che l’ecografia polmonare (LUS) possa essere utile, poiché può consentire l’esecuzione contemporanea dell’esame clinico e dell’imaging polmonare al capezzale del malato da parte dello stesso medico (Buonsenso 2020, Soldati 2020). I potenziali vantaggi della LUS includono la trasportabilità, l’esame al letto del malato, la sua sicurezza e la possibilità di ripetere l’esame durante il follow-up. L’esperienza, in particolare dell’Italia, con l’utilizzo dell’ecografia polmonare come intervento al capezzale del malato ha migliorato la valutazione dell’interessamento polmonare e può anche ridurre l’uso di radiografie del torace e TC. Si utilizza una valutazione a punti per regione e per quadro agli ultrasuoni (Vetrugno 2020). Tuttavia, il ruolo diagnostico e prognostico di LUS nella COVID-19 è ancora incerto.

Non è ancora chiaro se esista una potenziale utilità clinica di altre tecniche di imaging come l’imaging PET/CT 18F-FDG nella diagnosi differenziale dei casi complessi (Deng 2020, Qui 2020).

Nei pazienti con sintomi neurologici, viene spesso eseguita la risonanza magnetica dell’encefalo. In 27 pazienti, il reperto di imaging più comune era rappresentato da anomalie del segnale corticale nelle immagini ottenute tramite sequenza FLAIR (37%), accompagnate da una restrizione della diffusione corticale o da un enhancement leptomeningeo (Kandemirli 2020). Tuttavia, la complessità del decorso clinico che comprende comorbilità, lunga degenza in terapia intensiva con associazioni di più farmaci, difficoltà respiratoria con episodi di ipossia può introdurre dei fattori confondenti e sarà difficile stabilire una chiara relazione causa-effetto tra l’infezione da COVID-19 e i reperti della risonanza magnetica.

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