Esami e procedure diagnostiche

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Di Christian Hoffmann

 

Diagnosi

L’identificazione rapida e l’isolamento degli individui infetti è fondamentale. La diagnosi viene effettuata utilizzando caratteristiche cliniche, di laboratorio e radiologiche. Poiché i sintomi e i risultati radiologici di COVID-19 non sono specifici, l’infezione da SARS-CoV-2 deve essere confermata dalla reazione a catena della polimerasi a base di acido nucleico (PCR), amplificando una specifica sequenza genetica nel virus. Pochi giorni dopo la pubblicazione dei primi casi, è stato presentato un workflow diagnostico convalidato per SARS-CoV-2 (Corman 2020), a dimostrazione dell’enorme capacità di risposta raggiunta attraverso il coordinamento dei laboratori accademici e pubblici nelle reti di ricerca nazionali ed europee.

Esiste una guida provvisoria per i test diagnostici per il COVID-19 nei casi di sospetto umano, pubblicata dall’OMS a marzo e aggiornata l’11 settembre 2020 (OMS 20200911). Recentemente sono state inoltre pubblicate diverse revisioni complete e aggiornate riguardanti tecniche di laboratorio per la diagnosi del SARS-CoV-2 (Kilic 2020, Loeffelholz 2020).

Secondo l’OMS, la decisione di effettuare il test “dovrebbe essere basata su fattori sia clinici che epidemiologici”, al fine di supportare la gestione clinica dei pazienti e le misure di controllo delle infezioni. Nei pazienti sintomatici, un test PCR dovrebbe essere eseguito immediatamente, soprattutto per i professionisti medici con sintomi. In particolare, questo vale per le case di cura e altre strutture a lungo termine dove possono verificarsi grandi epidemie con elevata mortalità tra i residenti. In questi contesti, ogni giorno conta: sia i residenti che gli operatori sanitari devono essere sottoposti immediatamente a test. Nelle analisi di regressione tra 88 case di cura con un caso documentato prima che si verificasse il test a livello di struttura, ogni giorno in più tra l’identificazione del primo caso e il completamento del test a livello di struttura è stato associato all’identificazione di 1,3 casi aggiuntivi (Hatfield 2020). Tuttavia, il valore predittivo dei test varia notevolmente a seconda del tempo di esposizione e dell’insorgenza dei sintomi. Il tasso di falsi negativi è più basso 3 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi, o circa 8 giorni dopo l’esposizione (vedi sotto).

In ambienti con risorse limitate, tuttavia, i pazienti dovrebbero essere sottoposti a test solo se un test positivo porta ad un’azione obbligatoria. Non ha necessariamente senso tentare di accertare la prevalenza dell’infezione da PCR. Ad esempio, in una famiglia che è stata messa in quarantena dopo che l’infezione è stata confermata in un membro, non tutti i contatti domestici devono essere testati, soprattutto i giovani con sintomi lievi.

Per molti paesi e regioni, ci sono raccomandazioni costantemente aggiornate da parte di autorità e istituzioni su chi deve essere testato da chi e quando: queste raccomandazioni sono in continuo cambiamento e devono essere adattate alla situazione epidemiologica locale. Più bassi sono i tassi di infezione e maggiori sono le capacità di analisi, più pazienti potranno essere sottoposti al test.

Raccolta di campioni

Apparato respiratorio

Il SARS-CoV-2 può essere rilevata in una vasta gamma di diversi tessuti e fluidi corporei. In uno studio su 1.070 campioni raccolti da 205 pazienti con COVID-19 (Wang X 2020), i campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare hanno mostrato le più alte percentuali di positivi (14 su 15); 93%), seguiti dall’espettorato (72 su 104; 72%), tamponi nasali (5 su 8; 63%), biopsia a pennello per fibrobronchoscopia (6 su 13; 46%), tamponi faringei (126 su 398; 32%), feci (44 su 153; 29%) e sangue (3 su 307; 1%).

Anche se le secrezioni respiratorie possono avere una composizione molto variabile, i campioni respiratori rimangono il tipo di campione scelto per la diagnostica. La replicazione virale del SARS-CoV-2 è molto elevata nei tessuti del tratto respiratorio superiore, dirversamente da SARS-CoV (Wolfel 2020). Secondo l’OMS, il materiale respiratorio per la PCR dovrebbe essere raccolto da campioni delle vie respiratorie superiori (tampone nasofaringeo e orofaringeo o lavaggio) in pazienti ambulatoriali (OMS 2020). È preferibile raccogliere campioni da tamponi sia rinofaringei che orofaringei che possono essere combinati nella stessa provetta. Oltre ai tamponi rinofaringei, i campioni possono essere prelevati dall’espettorato (se producibile), dall’aspirato endotracheale o dal lavaggio broncoalveolare. È probabile che i campioni delle vie respiratorie inferiori siano più sensibili dei tamponi rinofaringei. Soprattutto nei pazienti gravemente malati, spesso c’è più virus nel tratto respiratorio inferiore che in quello superiore (Huang 2020). Tuttavia, c’è sempre un alto rischio di “aerosolizzazione” e quindi il rischio che i membri del personale si infettino.

Uno studio prospettico in due ospedali regionali di Hong Kong ha esaminato 563 campioni seriali raccolti durante il periodo di dispersione virale di 50 pazienti: 150 di saliva della gola profonda (DTS), 309 tamponi nasofaringei (NP) e tamponi per la gola in pool e 104 per l’espettorato (istruzioni per la saliva della gola profonda: prima pulire la gola facendo i gargarismi con la propria saliva, e poi sputare il DTS in un flacone sterile). La saliva della gola profonda ha prodotto la più bassa concentrazione di RNA virale e una minore percentuale di RT-PCR positiva rispetto ai campioni respiratori convenzionali. Nemmeno i tamponi buccali funzionano bene. In 11 bambini positivi tramite tamponi nasofaringei, 2 hanno dato esiti negativi tramite tamponi buccali. C’è stata una tendenza generale dei campioni buccali di contenere minori carichi virali di SARS-CoV-2 rispetto ai campioni rinofaringei (Kam 2020).

Tamponi nasofaringei – problemi pratici

È importante eseguire correttamente il processo del tampone. Sia il tampone nasofaringeo che quello orofaringeo hanno una serie di possibilità di errore che possono portare a falsi negativi. Inoltre, è necessario adottare misure di protezione per non mettere in pericolo l’esaminatore. Ogni tampone comporta un alto rischio di infezione! Sono necessarie protezioni per le vie respiratorie, occhiali protettivi, camice e guanti. È necessario esercitarsi a indossare e togliere correttamente gli indumenti protettivi! Molti errori si verificano anche solo togliendo la maschera protettiva. La raccolta di campioni da tamponi nasofaringei e gola può causare disagio ai pazienti e mettere a rischio gli operatori sanitari. Se non viene eseguita correttamente o in pazienti con anatomia complessa e delicata, vi è il rischio di eventi avversi come la perdita di liquido cerebrospinale (Sullivan 2020). C’è un video molto utile sulla protezione, la preparazione, l’attrezzatura, la manipolazione, la rimozione dei dispositivi di protezione individuale, ecc. (Marty 2020).

Per lo striscio, il paziente dovrebbe sedersi su una sedia e mettere la testa leggermente indietro. L’esaminatore dovrebbe stare in piedi in posizione leggermente sfalsata per evitare eventuali gocce di tosse. Dite al paziente che potrebbe essere scomodo per un breve periodo di tempo. Si dovrebbero usare tamponi adatti al rilevamento di virus e con il fusto in plastica più flessibile possibile. I bastoncini di legno possono disattivare i virus e comportare un elevato rischio di lesioni. Il tampone dovrebbe essere tenuto tra il pollice e l’indice, come una matita, in modo che l’estremità non tocchi nulla. La parete posteriore del rinofaringe è spesso raggiunta dopo 5-7 cm, indicata da una leggera resistenza. I tamponi nasali a media turbolenza possono essere meno sensibili (Pinninti 2020). Il contatto con i denti e la lingua dovrebbe essere evitato quando si prende un tampone per la gola; il tampone dovrebbe essere rimosso dalla parete posteriore, direttamente accanto all’ugola. Attenzione al riflesso faringeo! Su Internet sono disponibili numerosi video pratici per la corretta esecuzione del processo di prelievo del tampone.

Al fine di ridurre al minimo il rischio di esposizione per gli operatori sanitari e l’esaurimento dei dispositivi di protezione individuale, abbiamo stabilito delle istruzioni per il tampone per i pazienti che sono in grado di farlo (cioè, la maggior parte di loro!) a casa. Dopo un’adeguata istruzione, possono eseguire i tamponi da soli. Un corriere con le provette viene inviato direttamente a casa del paziente e il corriere posiziona le provette alla porta. Il contatto diretto tra il paziente e il corriere deve essere evitato. Le provette con i tamponi non devono essere toccate dal corriere (o metterle direttamente in un sacchetto o raccoglierle con un sacchetto rovesciato) e devono essere riportate direttamente a casa (nessuna spedizione!). Ciò richiede un’istruzione preventiva e precisa, ma di solito è abbastanza fattibile. La raccolta non supervisionata di tamponi a domicilio è paragonabile alla raccolta di tamponi nasofaringei da parte di un medico (McCulloch 2020). In uno dei più grandi studi condotti finora, a un totale di 530 pazienti con infezione delle vie respiratorie superiori sono state fornite istruzioni e gli è stato chiesto di raccogliere campioni di lingua, nasale e turbinato medio (Tu 2020). Un campione nasofaringeo è stato poi raccolto dal paziente da un operatore sanitario. Quando questo campione NP è stato utilizzato come comparatore, la sensibilità stimata dei campioni di lingua, nasale e turbinato medio raccolti dai pazienti è stata rispettivamente dell’89,8%, 94,0% e 96,2%.

I tamponi possono essere conservati asciutti o in una piccola quantità di soluzione di NaCl; se necessario, questo deve essere chiarito preventivamente con il laboratorio. L’esame PCR rapido è importante, va effettuato preferibilmente lo stesso giorno, se possibile, lo stesso giorno. Il calore e la conservazione possono portare a risultati falsi negativi (Pan 2020).

I campioni delle vie respiratorie inferiori possono includere l’espettorato (se prodotto) e/o l’aspirato endotracheale o il lavaggio broncoalveolare in pazienti con malattie respiratorie più gravi. Tuttavia, deve essere considerato un elevato rischio di aerosolizzazione (attenersi rigorosamente alle procedure di prevenzione e controllo delle infezioni). Ulteriori campioni clinici possono essere raccolti essendo il virus COVID-19 stato rilevato nel sangue e nelle feci (vedi sotto).

A differenza di molti virus respiratori, SARS-CoV-2 è presente nella saliva e diversi studi hanno dimostrato che i campioni di saliva orofaringei posteriori (gola profonda) sono fattibili e più accettabili per i pazienti e gli operatori sanitari (To 2020, Yu 2020, Wyllie 2020, Yokota 2020). In un ampio studio su campioni di saliva “migliorati” (fiuto forte, tosse provocata e raccolta di saliva/secrezioni) di 216 pazienti con sintomi ritenuti coerenti con COVID-19, si è riscontrato un accordo positivo al 100% (38/38 campioni positivi) e negativo al 99,4% (177/178 campioni negativi).

Spargimento fecale

Sebbene non siano ancora stati segnalati casi di trasmissione per via fecale-orale, è anche dimostrato che il SARS-CoV-2 si sta replicando attivamente nel tratto gastrointestinale. Diversi studi hanno mostrato la presenza prolungata di RNA virale del SARS-CoV-2 in campioni fecali (Chen 2020, Wu 2020). Combinando i risultati di 26 studi, una rapida revisione ha rivelato che il 54% dei pazienti testati per l’RNA fecale erano positivi. La durata della dispersione virale fecale variava da 1 a 33 giorni dopo un tampone rinofaringeo negativo (Gupta 2020). In un’altra metanalisi di 17 studi, il tasso di rilevazione in pool di SARS-CoV-2 RNA fecale era del 44% e 34% per paziente e numero di campioni, rispettivamente. I pazienti che presentavano sintomi gastrointestinali (77% vs. 58%) o con una malattia più grave (68% vs. 35%) tendevano ad avere un tasso di rilevamento più elevato.

Questi studi hanno sollevato dubbi sul fatto che i pazienti con tamponi faringei negativi siano veramente privi di virus o se sia necessario un campionamento di ulteriori siti corporei. Tuttavia, la rilevanza clinica di questi risultati rimane poco chiara e c’è uno studio che non ha rilevato virus infettivi da campioni di feci, nonostante le elevate concentrazioni di RNA del virus (Wolfel 2020). Pertanto, la presenza di acido nucleico da solo non può essere utilizzata per definire la dispersione virale o il potenziale di infezione (Atkinson 2020). Per molte malattie virali, tra cui il SARS-CoV o la MERS-CoV, è noto che l’RNA virale può essere rilevato molto tempo dopo la scomparsa del virus infettivo.

Esemplari diversi da quelli respiratori e gastrointestinali: sangue, urine, latte materno

  • Sangue – nei pazienti con malattia lieve o moderata, SARS-CoV-2 è relativamente raramente rilevato nel sangue (Wang W 2020, Wolfel 2020). In uno studio di screening su 7.425 donazioni di sangue a Wuhan, dei campioni di plasma sono risultati positivi all’RNA virale di 2 donatori asintomatici (Chang 2020). Un altro studio dalla Corea ha trovato sette donatori di sangue asintomatici che sono stati successivamente identificati come COVID-19 casi confermati. Nessuno dei 9 riceventi di piastrine o di trasfusioni di globuli rossi è risultato positivo al SARS-CoV-2 RNA. La trasmissione per trasfusione del SARS-CoV-2 è stata considerata improbabile (Kwon 2020). Come per le feci, non è chiaro se l’RNA rilevabile nel sangue significhi infettività. In uno studio su 167 pazienti ospedalizzati, SARS-CoV-2 è stato trovato in 64 pazienti ricoverati, 3 su 106 pazienti sierici negativi alla PCR e 15 di 61 pazienti positivi sono morti (Hagman 2020). Tuttavia, il significato clinico del SARS-CoV-2 “RNAemia” deve essere definito.
  • Urina – Nessuno dei 72 campioni di urina è risultato positivo (Wang X 2020).
  • Latte materno – in un case report, SARSCoV2 RNA è stato rilevato in campioni di latte materno di una madre infetta per 4 giorni consecutivi. L’individuazione di RNA virale nel latte ha coinciso con sintomi COVID19 lievi e con un test diagnostico positivo a SARS-CoV-2 del neonato (Groß 2020). Tuttavia, questo sembra essere raro. Su 64 campioni di latte materno di 18 donne infette, l’RNA SARS-CoV-2 è stato rilevato in un solo campione di latte; la coltura virale per quel campione era negativa. Questi dati suggeriscono che l’RNA SARS-CoV-2 non rappresenta un virus replicabile e che il latte materno potrebbe non essere una fonte di infezione per il lattante (Camere 2020. Sono stati segnalati anche casi di trasmissione di anticorpi nel latte materno (Dong 2020).
  • Fluido vaginale – tutti i campioni di 10 donne con COVID-19 sono risultati negativi (Saito 2020).
  • Sperma – Assenza di virus nei campioni raccolti da 12 pazienti in fase di recupero (Canzone 2020).
  • Lacrime e secrezioni congiuntivali – su 40 pazienti (10 con congiuntivite) che sono risultati positivi alla RT-PCR di tamponi nasofaringei e orofaringei, il tampone congiuntivale PCR è risultato positivo per 3 pazienti, tra cui uno con congiuntivite (Atum 2020). In un altro studio, non è stata riscontrata alcuna SARS-CoV-2 nelle lacrime (Meduri 2020).

PCR

Decine di test rRT-PCR interni e commerciali sono disponibili in tutto il mondo, poiché i laboratori di tutto il mondo hanno personalizzato i loro test PCR per il SARS-CoV-2, utilizzando diversi primer che mirano a diverse sezioni della sequenza genetica del virus. Recentemente è stata pubblicata una rassegna di diversi test e dispositivi diagnostici (Loeffelholz 2020). Un protocollo per i test PCR in tempo reale (RT)-PCR per il rilevamento del SARS-CoV-2 per due target RdRp (IP2 e IP4) è descritto su https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2.

I nuovi saggi RT-PCR in tempo reale che mirano alla RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp)/elicasi, spike e geni nucleocapsidici del SARS-CoV-2 possono aiutare a migliorare la diagnosi di laboratorio di COVID-19. Rispetto al test RdRp-P2 riportato, utilizzato nella maggior parte dei laboratori europei, questi test non reagiscono in modo incrociato con il SARS-CoV in coltura cellulare e possono essere più sensibili e specifici (Chan JF 2020).

I limiti di rilevazione dei kit commerciali possono essere sostanzialmente diversi. Tuttavia, la maggior parte degli studi comparativi ha dimostrato un’elevata sensibilità e la loro idoneità allo screening in tutto il mondo:

  • In un confronto tra 11 diversi sistemi di test RT-PCR utilizzati in sette laboratori in Germania nel marzo 2020, la maggior parte dei test RT-PCR ha rilevato circa 5 copie di RNA per reazione (Münchhoff 2020). Una sensibilità ridotta è stata notata per il protocollo originale di conferma del gene Charité RdRp, che potrebbe aver influito sulla conferma di alcuni casi nelle prime settimane della pandemia. Il set di primer/provocazioni CDC N1 era sensibile e robusto per il rilevamento del SARS-CoV-2 in estratti di acido nucleico da materiale respiratorio, feci e siero di pazienti affetti da COVID-19.
  • Limiti analitici di rilevazione per sette saggi SARS-CoV-2 che utilizzano diluizioni seriali di materiale paziente in pool quantificato con PCR digitale a goccia. I limiti di rilevazione variavano da ≤ 10 a 74 copie/ml per gli analizzatori di laboratorio commerciali ad alta produttività (Roche cobas, Abbott m2000, e Hologic Panther Fusion) e da 167 a 511 copie/ml per gli strumenti sample-to-answer (DiaSorin Simplexa, GenMark ePlex) e gli strumenti point-of-care (Abbott ID NOW) (Fung 2020).
  • In totale sono stati analizzati 239 campioni (168 contenevano il SARS-CoV-2) con cinque metodi di prova (Procop 2020). I saggi privi di una fase di estrazione dell’acido nucleico hanno prodotto più reazioni falso-negative rispetto ai saggi che includevano questa fase. I tassi di falsi negativi sono stati dello 0% per il CDC 2019 nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, del 3,5% per il TIB MOLBIOL Assay (Roche), del 2,4% per Xpert Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid), dell’11,9% per Simplexa COVID-19 Direct Kit (DiaSorin), e del 16,7% per l’ID NOW COVID-19 (Abbott). La maggior parte dei falsi negativi sono stati visti in pazienti con basse cariche virali.

PCR qualitativa

Una PCR qualitativa (“positiva o negativa”) è di solito sufficiente nella diagnostica di routine. La quantificazione dell’RNA virale è attualmente (ancora) solo di interesse accademico.

I falsi risultati positivi sono molto rari. Tuttavia, si verificano. Anche se la specificità analitica di questi test è di solito al 100%, la specificità clinica è minore, a causa della contaminazione (un problema significativo per le procedure NAT) e/o dell’errore umano nella manipolazione dei campioni o dei dati (molto difficile da eliminare completamente). Come visto con la sierologia (vedi sotto), questi risultati falsi positivi possono avere effetti sostanziali quando la prevalenza è bassa (Andrew Cohen, comunicazione personale).

La maggior parte dei test PCR sono progettati per rilevare due o più regioni specifiche del gene target. Raramente, un risultato non conclusivo può verificarsi quando viene rilevato solo uno dei target (< 1%). Esistono algoritmi quantitativi per valutare e interpretare i risultati non conclusivi della PCR, combinando dati di laboratorio, clinici ed epidemiologici (Yang S 2020).

Un altro problema di qualsiasi PCR qualitativa è rappresentato dai falsi risultati negativi che possono avere molte cause (revisione: Woloshin 2020). Le sbavature errate sono particolarmente comuni, ma si verificano anche errori di laboratorio. In una revisione di 7 studi con un totale di 1.330 campioni respiratori, gli autori hanno stimato il tasso di falsi negativi della RT-PCR di giorno dopo l’infezione. Nei 4 giorni precedenti l’insorgenza dei sintomi, il tasso è sceso dal 100% al 67%. Il giorno dell’insorgenza dei sintomi (5° giorno), il tasso è stato del 38%, scendendo al 20% (8° giorno) per poi ricominciare ad aumentare dal 21% (9° giorno) al 66% (21° giorno). Se il sospetto clinico è elevato, l’infezione non deve essere esclusa sulla base della sola RT-PCR. Il tasso di falsi negativi è più basso 3 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi, o circa 8 giorni dopo l’esposizione (Kucirka 2020). La Figura 1 illustra la PCR e il rilevamento degli anticorpi durante l’infezione da SARS-CoV-2.

 

Figura 1. Timeline dei marcatori diagnostici per il rilevamento del SARS-CoV-2. AB = Anticorpo.

 

È necessario ripetere il test in caso di PCR negativa? Diversi studi si oppongono a questa strategia, trovando tassi molto bassi di conversione da negativo a positivo con test ripetuti (Lepak 2020). Su 20.912 pazienti, uno studio ha analizzato la frequenza della discordanza del test RT-PCR SARS-CoV-2 tra gli individui che inizialmente risultavano negativi al test con tampone rinofaringeo e che sono stati ritestati per motivi clinici entro 7 giorni. La frequenza di positività successiva all’interno di questa finestra è stata solo del 3,5% e simile in tutte le istituzioni (Long 2020). Sembra che se la prima PCR è negativa, una seconda PCR produce solo un piccolo numero di risultati positivi.

Diversi studi hanno dimostrato che anche i pazienti asintomatici hanno risultati positivi alla PCR e possono trasmettere il virus (Bai 2020, Cereda 2020, Rothe 2020). I valori soglia del ciclo di RT-PCR per il SARS-CoV-2 (“carica virale”) nei pazienti asintomatici sono simili a quelli dei pazienti sintomatici (Lee S 2020, Lavezzo 2020).

Nei pazienti sintomatici, la dispersione virale può iniziare 2 o 3 giorni prima della comparsa dei primi sintomi. Analizzando un totale di 414 tamponi per la gola in 94 pazienti, la più alta carica virale in tamponi per la gola è stata trovata al momento dell’insorgenza dei sintomi. L’infezione è iniziata 2,3 giorni prima dell’insorgenza dei sintomi (95% di IC, 0,8-3,0 giorni) e ha raggiunto un picco di 0,7 giorni prima dell’insorgenza dei sintomi (He 2020). Si stima che l’infettività sia diminuita rapidamente entro 7 giorni.

In una coorte di 113 pazienti sintomatici, la durata mediana del rilevamento del SARS-CoV-2 RNA è stata di 17 giorni (interquartili 13-22 giorni), misurata dall’inizio della malattia. In alcuni pazienti, la PCR è stata positiva anche più a lungo: il sesso maschile e un decorso grave (ventilazione meccanica invasiva) sono stati fattori di rischio indipendenti per la perdita prolungata (Xu K 2020). È da notare che i pazienti immunocompromessi possono mantenere il virus infettivo per un periodo di tempo più lungo di quello precedentemente riconosciuto. In alcuni di questi pazienti, la dispersione del SARS-CoV-2 infettiva è stata osservata fino a 3-5 mesi o anche più a lungo (Avanzato 2020, Choi 2020).

Diverse segnalazioni di pazienti hanno ripetutamente guadagnato molto interesse da parte dei media, mostrando risultati positivi dopo ripetute PCR negative e guarigione clinica (Lan 2020, Xiao AT 2020, Yuan 2020). Questi studi hanno sollevato la questione della riattivazione o della reinfezione di COVID-19 (vedi sotto, capitolo Presentazione clinica, 247). Tuttavia, sembra probabile che i risultati siano molto più probabili a causa di problemi metodologici (Li 2020). A bassi livelli di virus, soprattutto durante gli ultimi giorni di infezione, la carica virale può fluttuare e a volte essere rilevabile, a volte no (Wolfel 2020). La riattivazione, e anche una rapida reinfezione sarebbe molto insolita per i coronavirus. In uno studio su campioni di tampone nasale/orofaringei di 176 pazienti recuperati senza febbre e con 2 risultati RT-PCR negativi per SARS-CoV-2 RNA a 24 ore di distanza l’uno dall’altro, 32 dei 176 campioni (18%) sono risultati positivi per il totale di SARS-CoV-2 RNA. Tutti avevano basse cariche virali e solo uno dei 32 campioni (3,1%) aveva un RNA replicante per il SARS-CoV-2 RNA (Liotti 2020).

Quantificazione della carica virale

Diversi studi hanno valutato la carica virale del SARS-CoV-2 in diversi campioni. In un piccolo studio prospettico, la carica virale in tamponi nasali e gola ottenuti da 17 pazienti sintomatici è stata analizzata in relazione al giorno di insorgenza di eventuali sintomi (Zou 2020). Da notare che la carica virale rilevata nei pazienti asintomatici era simile a quella dei pazienti sintomatici, il che suggerisce il potenziale di trasmissione dei pazienti asintomatici o minimamente sintomatici.

In un altro studio su 82 individui infetti, le cariche virali nei campioni di tampone per la gola e nell’espettorato hanno raggiunto un picco di circa 5-6 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi, da circa 79.900 copie/ml in gola a 752.000 copie per ml di espettorato (Pan 2020). In uno studio su campioni di saliva orofaringea, a differenza del SARS, i pazienti con COVID-19 avevano la più alta carica virale vicino alla presentazione, il che potrebbe spiegare la rapida diffusione di questa epidemia (Al 2020). La carica virale mediana nella saliva orofaringea posteriore o in altri campioni respiratori alla presentazione era di 5,2 log10 copie per mL (IQR 4.1-7.0) in questo studio. Su un totale di 323 campioni di 76 pazienti, la carica virale media nell’espettorato (17,429 copie/test) è stata significativamente più elevata rispetto ai tamponi della gola (2552 copie) e ai tamponi nasali (651 copie). La carica virale era più elevata nelle fasi iniziali e progressive rispetto alla fase di recupero (Yu 2020). Secondo uno studio pubblicato di recente, la dispersione virale può iniziare già 2-3 giorni prima della comparsa dei primi sintomi e il profilo di infettività può assomigliare più a quello dell’influenza che a quello della SARS (He 2020).

Cariche virali più elevate potrebbero essere associate a gravi esiti clinici. In un’ampia coorte (n = 1145) di pazienti ospedalizzati e sintomatici di New York, sono state misurate le cariche virali. In un modello di adattamento dei pericoli proporzionale di Cox per diversi fattori di confusione, c’è stata una significativa associazione indipendente tra la carica virale e la mortalità (rapporto di pericolo 1,07, 95% CI 1,03-1,11, p = 0,0014), con un aumento del 7% di pericolo per ogni copia/mL trasformata in tronco (Pujadas 2020). Tuttavia, sono necessari studi prospettici per valutare il ruolo della carica virale del SARS-CoV-2 come marker per valutare la gravità della malattia e la prognosi.

Dobbiamo misurare la carica virale? Probabilmente sì. Può essere utile nella pratica clinica. Un risultato positivo della RT-qPCR può non significare necessariamente che la persona sia ancora infettiva o che abbia ancora una malattia significativa. L’RNA potrebbe provenire da virus non vitali e/o la quantità di virus vivo potrebbe essere troppo bassa per la trasmissione.

Valori di soglia del ciclo (Ct)

RT-qPCR fornisce la quantificazione trascrivendo prima l’RNA inverso nel DNA, e poi eseguendo qPCR dove un segnale di fluorescenza aumenta proporzionalmente alla quantità di acido nucleico amplificato. Il test è positivo se la fluorescenza raggiunge una determinata soglia entro un certo numero di cicli di PCR (valore Ct, inversamente correlato alla carica virale). Molti saggi qPCR utilizzano un cut-off Ct di 40, consentendo di rilevare pochissime molecole di RNA di partenza. Alcuni esperti (Tom 2020) suggeriscono di utilizzare questo valore Ct o di calcolare la carica virale che può aiutare ad affinare il processo decisionale (isolamento più breve, ecc.). Purtroppo, c’è ancora un’ampia eterogeneità e incoerenza delle curve standard calcolate da studi che forniscono valori Ct da campioni di diluizione seriali e le cariche virali stimate. Secondo altri esperti, sono necessarie precauzioni nell’interpretazione dei valori Ct dei risultati di SARS-CoV-2 RT-PCR mostrati nelle pubblicazioni COVID-19 per evitare malintesi della cinetica della carica virale per il confronto tra i diversi studi (Han 2020). È necessaria cautela quando si considerano i valori Ct come un indicatore surrogato della “quantità” in un saggio PCR qualitativo (“carica virale”). I risultati non sono trasferibili tra i diversi saggi, i diversi target genici e i diversi tipi di campioni (Poon 2020).

Tuttavia, alcuni studi clinici chiave sono elencati qui:

  • In 678 pazienti con COVID-19, la mortalità in ospedale è stata del 35,0% con una “elevata carica virale” (Ct < 25; n = 220), del 17,6% con una “media carica virale” (Ct 25-30; n = 216), e del 6,2% con una “bassa carica virale” (Ct > 30; n = 242). L’alta carica virale è stata associata indipendentemente con la mortalità (odds ratio corretto 6,05; 95% CI: 2,92-12,52) e l’intubazione (aOR 2,73; 95% CI: 1,68-4,44) in modelli multivariati (Magleby 2020).
  • Un campionamento prospettico seriale di 70 pazienti ha rivelato valori Ct clinicamente rilevanti, vale a dire un Ct di 24 (“alta carica virale”), e > 40 (“negativo”), si è verificato 9 e 36 giorni dopo l’insorgenza del sintomo (Lesho 2020).
  • Su 93 membri della famiglia (compresi i casi indice) che sono risultati positivi al test SARS-CoV-2 con tampone NP, i valori Ct erano più bassi subito dopo l’esordio del sintomo ed erano significativamente correlati al tempo trascorso dall’esordio; entro 7 giorni dall’esordio del sintomo, il valore Ct mediano era di 26,5, rispetto a un valore Ct mediano di 35,0 a 21 giorni dall’esordio (Salvatore 2020).
  • La coltura del virus è stata tentata su 324 campioni (su 253 casi) che sono risultati positivi al SARS-CoV-2 mediante RT-PCR. I valori Ct sono fortemente correlati con il virus coltivabile. La probabilità di coltura del virus è scesa all’8% nei campioni con Ct > 35 e al 6% (95% CI: 0,9-31,2%) 10 giorni dopo l’inizio (Singanayagam 2020).
  • Uno studio trasversale ha determinato campioni positivi alla PCR per la loro capacità di infettare le linee cellulari. Di 90 campioni, solo il 29% ha dimostrato una crescita virale. Non c’è stata crescita nei campioni con un Ct > 24 o durata dei sintomi > 8 giorni (Bullard 2020).

Sistemi di prova diversi da quelli convenzionali RT-PCR

L’accesso alla diagnosi rapida è la chiave per il controllo della pandemia di SARS-CoV-2. In futuro, i test presso i punti di cura potrebbero alleggerire la pressione sui laboratori centralizzati e aumentare la capacità complessiva dei test. Oltre alla PCR, altri metodi di amplificazione/rilevamento potenzialmente validi, come il CRISPR (che mira a cluster regolarmente intervallati da brevi ripetizioni palindromiche), le tecnologie di amplificazione dell’acido nucleico isotermico (ad esempio, l’amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa RT-LAMP) e i saggi di microarray molecolari sono in fase di sviluppo o sono in fase di commercializzazione. Secondo l’OMS dell’11 settembre, la convalida delle prestazioni analitiche e cliniche di questi saggi, la dimostrazione della loro potenziale utilità operativa, la rapida condivisione dei dati, così come la revisione normativa di emergenza dei test producibili e performanti “sono incoraggiati ad aumentare l’accesso ai test SARS-CoV-2” (OMS 20200911).

Test al punto di cura

I test nei punti di cura sono dispositivi di facile utilizzo per facilitare i test al di fuori delle impostazioni di laboratorio (Guglielmi 2020, Joung 2020). Sono attesi con pazienza. Ma saranno dei veri e propri cambiamenti? Il 6 maggio la FDA ha concesso l’autorizzazione all’uso d’emergenza per un test fluorescente SARS-CoV-2 basato su CRISPR commercializzato da Sherlock Biosciences. Questo semplice test SARS-CoV-2 combina l’estrazione semplificata dell’RNA virale con l’amplificazione isotermica e la rilevazione mediata da CRISPR. I risultati sono disponibili entro un’ora con un equipaggiamento minimo. Primi risultati (n = 202 campioni positivi/200 negativi): sensibilità 93,1%, specificità 98,5% (Joung 2020). Tuttavia, il suo utilizzo rimane ancora limitato ai laboratori certificati per eseguire test di alta complessità. Ci sono altri rapporti di un test all-in-one doppio CRISPR-Cas12a (Ding 2020) che permette di incubare tutti i componenti in un unico vaso per il rilevamento dell’acido nucleico a base di CRISPR, consentendo una diagnostica molecolare semplice e all-in-one senza la necessità di operazioni manuali separate e complesse.

Il 6 maggio la FDA ha inoltre autorizzato (EUA) il saggio immunologico in fluorescenza dell’antigene di Sofia 2 SARS di Quidel. Questo test deve essere letto su un analizzatore dedicato e rileva la proteina nucleocapside SARS-CoV-2 da tamponi nasofaringei in 15 min. Secondo il produttore, il test ha dimostrato una sensibilità clinica accettabile e ha rilevato 47/59 infezioni (80%). In un altro studio, il cosiddetto test CovidNudge ha avuto una sensibilità del 94% e una specificità del 100% rispetto alla RT-PCR standard di laboratorio (Gibani 2020). In altri studi, la sensibilità era molto più bassa. Il test dell’antigene BIOCREDIT COVID-19 è risultato 10.000 volte meno sensibile dell’RT-PCR e ha rilevato tra l’11,1% e il 45,7% dei campioni RT-PCR-positivi dei pazienti affetti da COVID-19 (Mak 2020).

Oltre ai test sull’antigene, sono stati recentemente rilasciati diversi test di amplificazione rapida dell’acido nucleico (Collier 2020). Il saggio Abbott ID NOW COVID-19 (utilizzando l’amplificazione isotermica dell’acido nucleico del target virale RdRp) è in grado di produrre risultati positivi in soli 5 minuti. In uno studio, i risultati sono stati confrontati con RT-PCR Cepheid Xpert Xpress SARS-CoV-2 utilizzando tamponi nasofaringei (Basu 2020). Indipendentemente dal metodo di raccolta e dal tipo di campione, il test rapido ha avuto risultati negativi in un terzo dei campioni risultati positivi alla PCR quando si sono usati tamponi nasofaringei in mezzi di trasporto virale e nel 45% quando si sono usati tamponi nasali asciutti. Tali test “Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification” (RT-LAMP) potrebbero essere utilizzati al di fuori di un laboratorio centrale su vari tipi di campioni biologici. Possono essere completati da individui senza formazione o attrezzature speciali e possono fornire una nuova strategia diagnostica per combattere la diffusione del SARS-CoV-2 al punto di rischio (Lamb 2020).

Data la bassa (o ancora non dimostrata) sensibilità, questi test possono servire principalmente come strumento ausiliario precoce per identificare molto rapidamente gli individui infetti, cioè nell’unità di emergenza. Questi test aiutano ad evitare la chiusura dei letti, permettono di dimettere le persone in case di cura e accelerano l’accesso alle procedure ospedaliere. Alcuni esperti sono ancora più ottimisti: l’uso frequente di test economici, semplici e rapidi è essenziale, anche se la loro sensibilità analitica è di gran lunga inferiore a quella dei test di riferimento. La questione chiave non è quanto bene le molecole possano essere rilevate in un singolo campione – ma quanto efficacemente le infezioni possano essere rilevate in una popolazione attraverso l’uso ripetuto di un determinato test come parte di una strategia di test globale – la sensibilità del regime di test (Mina 2020).

Diagnosi nell’impostazione di una carenza di kit di test PCR

Non c’è dubbio che l’obiettivo generale deve essere quello di individuare il maggior numero possibile di infezioni. Tuttavia, in molti Paesi, una carenza di kit di prova di fornitura non soddisfa le esigenze di una popolazione infetta in crescita. Soprattutto nelle impostazioni a bassa prevalenza, il pooling dei campioni è un’opzione per ridurre i costi e velocizzare i risultati. In questo approccio, piccoli volumi di campioni provenienti da più pazienti vengono combinati in un unico test, con conseguente notevole risparmio di reagenti. Diversi studi hanno dimostrato che è possibile mettere in comune 5-10 campioni, senza compromettere i risultati (Ben-Ami 2020, Schmidt 2020). Tuttavia, il pooling non è così banale (Mallapaty 2020). Ci sono diversi avvertimenti ed è necessaria un’indagine attenta e rigorosa per assicurare che il pooling dei campioni non influisca sulla sensibilità analitica del saggio (revisione: Clark 2020).

Alcuni studi hanno indagato se la diagnosi in periodi e paesi ad alta prevalenza può essere fatta senza la rilevazione della PCR, se necessario. Un ampio studio retrospettivo con controllo controllo di Singapore ha valutato gli indicatori per l’infezione da SARS-CoV-2, utilizzando fattori di rischio di esposizione, variabili demografiche, risultati clinici e risultati di test clinici (Sun 2020). Anche in assenza di fattori di rischio di esposizione e/o di evidenza radiologica della polmonite, i risultati clinici e i test possono identificare soggetti ad alto rischio di COVID-19. Leucociti bassi, linfociti bassi, temperatura corporea più elevata, frequenza respiratoria più elevata, sintomi gastrointestinali e ridotta produzione di espettorato sono stati fortemente associati a un test SARS-CoV-2 positivo. Tuttavia, questi modelli di previsione preliminare sono sensibili al contesto epidemiologico locale e alla fase dell’epidemia globale. Essi hanno senso solo durante i periodi di alta incidenza. In altre parole: se vedo un paziente durante il picco di un’epidemia che si presenta con febbre, tosse, mancanza di respiro e linfopenia, posso essere quasi sicuro che questo paziente soffre di COVID-19. Durante le fasi in cui l’incidenza è più bassa, questi modelli non hanno senso. Non c’è dubbio che il test dell’acido nucleico serve come metodo standard per la conferma dell’infezione. Ogni volta che la PCR è disponibile, la PCR deve essere eseguita.

Sierologia (test anticorpale)

Il rilevamento delle infezioni virali del passato attraverso la ricerca degli anticorpi che una persona infetta ha prodotto sarà uno degli obiettivi più importanti nella lotta contro la pandemia COVID-19. Il test degli anticorpi è multiuso: questi test sierologici sono di fondamentale importanza per determinare la sieroprevalenza, la precedente esposizione e identificare i donatori umani altamente reattivi per la generazione di siero convalescente come terapeutico. Essi sosterranno la ricerca di contatti e lo screening degli operatori sanitari per identificare coloro che sono già immuni. Quante persone sono state realmente infettate, in quanti il virus è sfuggito alla diagnosi di PCR, e per quali ragioni, quanti pazienti sono asintomatici e qual è il tasso di mortalità reale in una popolazione definita? Solo con test sierologici completi (e studi epidemiologici ben pianificati) saremo in grado di rispondere a queste domande e di ridurre l’onnipresente numero non dichiarato nei calcoli attuali. Diverse indagini sono già in corso in una grande varietà di località in tutto il mondo.

Nelle ultime settimane è diventato chiaro che i test sierologici possono essere utili anche come strumento diagnostico complementare per COVID-19. La sieroconversione di anticorpi specifici IgM e IgG è stata osservata già il 4° giorno dopo l’insorgenza dei sintomi. Gli anticorpi possono essere rilevati nella fase intermedia e nelle fasi successive della malattia (Guo L 2020, Xiao DAT 2020). Se una persona con un COVID-19 altamente sospettoso rimane negativa al test PCR e se i sintomi sono in corso per almeno diversi giorni, gli anticorpi possono essere utili e migliorare la sensibilità diagnostica.

Tuttavia, il test degli anticorpi non è banale. L’eterogeneità molecolare dei sottotipi SARS-CoV-2, le prestazioni imperfette dei test disponibili e la reattività incrociata con i CoV stagionali devono essere considerate (recensioni: Cheng 2020, Krammer 2020). Secondo un’analisi Cochrane su 57 pubblicazioni con 15.976 campioni, la sensibilità dei test anticorpali è troppo bassa nella prima settimana dall’insorgenza dei sintomi per avere un ruolo primario nella diagnosi di COVID-19. Tuttavia, questi test possono ancora avere un ruolo complementare ad altri test in individui che si presentano in seguito, quando i test RT-PCR sono negativi o non vengono eseguiti (Deeks 2020). È probabile che i test anticorpali abbiano un ruolo utile nel rilevare una precedente infezione da SARS-CoV-2 se utilizzati 15 o più giorni dopo l’insorgenza dei sintomi. I dati oltre i 35 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi sono scarsi. Secondo gli autori, gli studi sull’accuratezza dei test COVID-19 richiedono un notevole miglioramento. Gli studi devono riportare i dati sulla sensibilità a seconda del tempo trascorso dall’insorgenza dei sintomi. Una panoramica pratica delle insidie dei test anticorpali e di come comunicare il rischio e l’incertezza è fornita da Watson 2020.

Test

La sensibilità media e la specificità dei test anticorpali approvati dalla FDA sono rispettivamente dell’84,9% e del 98,6%. Data la prevalenza variabile di COVID-19 (1%-15%) in diverse parti, statisticamente il valore predittivo positivo sarà compreso tra il 30% e il 50% nelle aree a bassa prevalenza (Mathur 2020). Recentemente è stata pubblicata una revisione sistematica di 40 studi sulla sensibilità e la specificità (Lisboa-Bastos2020), stratificati con il metodo dei test sierologici (test immunoassorbenti legati agli enzimi – ELISA), immunodosaggi a flusso laterale (LFIA), o immunodosaggi in chemiluminescenza – CLIA). La sensibilità combinata degli ELISA che misurano le IgG o le IgM è stata dell’84,3% (intervallo di confidenza del 95% dal 75,6% al 90,9%), delle LFIA è stata del 66,0% (dal 49,3% al 79,3%) e delle CLIA è stata del 97,8% (dal 46,2% al 100%). Secondo gli autori, sono urgentemente necessari studi clinici di qualità superiore che valutino l’accuratezza diagnostica dei test sierologici per il COVID-19.

Krammer 2020 fornisce una bella panoramica delle diverse piattaforme, compresi i saggi vincolanti come i saggi di immunoassorbimento legati agli enzimi (ELISA), i saggi di flusso laterale o i saggi basati su Western blot. Inoltre, i saggi funzionali che testano la neutralizzazione del virus, l’inibizione degli enzimi o i saggi battericidi possono anche informare sulle risposte immunitarie mediate dagli anticorpi. Sono discussi anche molti avvertimenti e domande aperte riguardo al test degli anticorpi.

Il test anticorpale di solito si concentra sugli antigeni (proteine). Nel caso del SARS-CoV-2, vengono utilizzati diversi kit ELISA basati sulla proteina ricombinante nucleocapside e sulla proteina spike (Loeffelholz 2020). La proteina spike SARS-CoV-2 sembra essere l’obiettivo migliore. Tuttavia, è meno ovvio quale parte della proteina spike utilizzare, ciò dipende dall’unicità della proteina spike. Più è unica, più basse sono le probabilità di cross-reattività con altri coronavirus – falsi positivi derivanti dall’immunità ad altri coronavirus. La reattività crociata con altri coronavirus può essere impegnativa. I cosiddetti test di conferma (di solito test di neutralizzazione) possono essere usati per ridurre i test di falsi positivi. Tuttavia, il rilevamento e la quantificazione degli anticorpi neutralizzanti sono relativamente poco efficaci e limitati ai laboratori di ricerca attrezzati per il livello di biosicurezza 3. Per evitare test di neutralizzazione che richiedono un patogeno vivo e un laboratorio di biosicurezza di livello 3, diversi studi hanno proposto test basati sul blocco anticorpo-mediato dell’interazione tra la proteina del recettore ACE2 e il dominio legante del recettore. I test hanno raggiunto una specificità del 99,93% e una sensibilità del 95-100% (Tan 2020).

Anche con una specificità molto elevata del 99% e oltre, tuttavia, soprattutto nelle aree a bassa prevalenza, il valore informativo dei test anticorpali è limitato e si può ipotizzare un alto tasso di falsi positivi. Un esempio: Con una specificità del 99%, ci si aspetta che un test su 100 sia positivo. In un’impostazione ad alta prevalenza, questo è meno rilevante. Tuttavia, se una persona viene sottoposta a test in un’impostazione a bassa prevalenza, la probabilità che un test positivo sia realmente positivo (il valore predittivo positivo, cioè il numero di test realmente positivi diviso per il numero di tutti i test positivi) è bassa. In una popolazione con una data prevalenza dell’1%, il valore predittivo sarebbe solo del 50%! Le stime attuali dell’Islanda, una popolazione ben definita ma non selezionata, hanno mostrato ancora un tasso relativamente costante di circa lo 0,8% nel marzo 2020 (Gudbjartsson 2020). Anche nei Paesi apparentemente più colpiti, i tassi di infezione sono solo leggermente più elevati. Lo screening generale degli anticorpi in queste popolazioni produrrà quindi un tasso abbastanza elevato di falsi positivi. Quando si valuta lo stato immunitario anti-SARS-CoV-2 in individui con bassa probabilità di pre-test, può essere meglio confermare i risultati positivi di singole misurazioni con test sierologici o funzionali alternativi (Behrens 2020).

Alcuni studi chiave con valutazioni testa a testa di diversi immunodosaggi

  • Abbott, EUROIMMUN e l’Elecsys (Roche): Il saggio di Abbott ha dimostrato il minor numero di risultati falsi negativi > 14giorgni dopo l’insorgenza dei sintomi e il minor numero di risultati falsi positivi. Mentre il saggio Roche ha rilevato più risultati positivi in precedenza dopo l’insorgenza dei sintomi, nessuno dei saggi ha dimostrato una sensibilità clinica sufficientemente elevata prima del 14° giorno dall’insorgenza dei sintomi alla diagnosi di infezione acuta (Tang 2020).
  • Abbott, LIAISON (DiaSorin), Elecsys (Roche), Siemens, più un romanzo in-house 384-well (Oxford) ELISA in 976 (!) campioni di sangue pre-pandemici e 536 (!) campioni di sangue con infezione confermata da SARS-CoV-2. Tutti i test hanno avuto un’alta sensibilità (92,7-99,1%) e specificità (98,7-99,9%). Il test più sensibile valutato è stato l’ELISA interno. Il saggio Siemens e l’immunodosaggio di Oxford hanno raggiunto il 98% di sensibilità/specificità senza ulteriori ottimizzazioni. Tuttavia, un limite è stato il numero ridotto di casi pauci-sintomatici e asintomatici analizzati (NAEG 2020).
  • Abbott, Epitope Diagnostics, EUROIMMUN, e Ortho Clinical Diagnostics: tutti e quattro i test immunologici sono stati eseguiti in modo simile per quanto riguarda la sensibilità nei pazienti ospedalizzati con COVID-19 e, ad eccezione del test Epitope, anche in individui con forme più lievi dell’infezione (Theel 2020). Gli immunodosaggi Abbott e Ortho Clinical hanno fornito la più alta specificità complessiva, di oltre il 99%.
  • Sei test anticorpali SARS-CoV-2, ovvero Beckman Coulter, EUROIMMUN (IgG, IgA), Roche e Siemens (Centaur, Vista) sono stati valutati per la specificità (n = 184), la sensibilità (n = 154) e la sieroconversione in una coorte definita con correlati clinici e risultati di SARS-CoV-2 molecolari. La specificità del test è risultata pari o superiore al 99% per tutti i test, ad eccezione di Euroimmun IgA (95%). La sensibilità a più di 21 giorni dall’inizio del sintomo è stata dell’84%, 95%, 72%, 98%, 67% e 96% per Beckman Coulter, Centaur, Vista, Roche, Vista, Roche, Euroimmun IgA e Euroimmun IgG, rispettivamente. Questi risultati hanno sollevato alcune preoccupazioni sul fatto che gli studi di sieroprevalenza possono variare in modo significativo in base al saggio sierologico utilizzato (Zilla 2020).

Indicazione nella pratica clinica

Ma al di fuori degli studi clinici, chi dovrebbe essere testato ora? I test non hanno in realtà alcun senso per i pazienti con una precedente e comprovata malattia COVID-19. Tuttavia, si può comunque fare se, ad esempio, si vuole convalidare un test. Oltre a coloro che si occupano di assistenza sanitaria o che lavorano in altre professioni ad alto rischio di trasmissione, tali test possono essere utili anche per identificare retrospettivamente possibili persone di contatto. Tuttavia, misuriamo gli anticorpi solo quando il risultato del test potrebbe avere delle conseguenze. I pazienti dovrebbero essere informati del basso valore predittivo positivo, specialmente in quelli che non hanno alcuna evidenza di malattia o esposizione a COVID-19. In questi pazienti, il test degli anticorpi non è raccomandato. Al di fuori dei punti caldi epidemiologici, in paesi a bassa prevalenza come la Germania, praticamente tutti sono ancora sieronegativi. Se positivo, il valore predittivo è troppo basso.

La cinetica degli anticorpi

Le risposte sierologiche ai coronavirus sono solo transitorie. Una brillante revisione sistematica dell’immunità anticorpo-mediata ai coronavirus (cinetica, correlazioni di protezione e associazione con la gravità) è stata recentemente pubblicata (Huang AT 2020).

Gli anticorpi contro altri coronavirus umani stagionali possono scomparire anche dopo pochi mesi. I dati preliminari suggeriscono che il profilo degli anticorpi contro il SARS-CoV-2 è simile al SARS-CoV (Xiao DAT 2020). Per il SARS-CoV, gli anticorpi non sono stati rilevati entro i primi 7 giorni di malattia, ma il titolo IgG è aumentato drasticamente il giorno 15, raggiungendo un picco il giorno 60, ed è rimasto alto fino al giorno 180 da quando è diminuito gradualmente fino al giorno 720. Le IgM sono state rilevate il 15° giorno e hanno raggiunto rapidamente un picco, per poi diminuire gradualmente fino a non essere rilevabili il 180° giorno (Mo 2006). Come per altri virus, gli anticorpi IgM si presentano un po’ prima degli anticorpi IgG, che sono più specifici. Gli anticorpi IgA sono relativamente sensibili ma meno specifici (Okba 2020).

Il primo studio più ampio sulla risposta umorale dell’ospite contro il SARS-CoV-2 ha dimostrato che questi test possono aiutare la diagnosi di COVID-19, compresi i casi subclinici (Guo 2020). In questo studio, la risposta IgA, IgM e IgG utilizzando un saggio basato su ELISA sulla proteina nucleocapside virale ricombinante è stata analizzata in 208 campioni di plasma di 82 casi confermati e 58 casi probabili (Guo 2020). La durata mediana della rilevazione degli anticorpi IgM e IgA è stata di 5 giorni (IQR 3-6), mentre le IgG sono state rilevate il 14° giorno (IQR 10-18) dopo l’insorgenza dei sintomi, con una percentuale positiva dell’85%, 93% e 78% rispettivamente. L’efficienza di rilevazione con l’ELISA IgM è stata superiore a quella della PCR dopo 5,5 giorni dall’insorgenza dei sintomi. In un altro studio su 173 pazienti, i tassi di sieroconversione (tempo mediano) per IgM e IgG sono stati rispettivamente dell’83% (12 giorni) e del 65% (14 giorni). Un titolo di anticorpi più elevato è stato indipendentemente associato a una malattia grave (Zhao 2020). In altri studi, tuttavia, il livello di anticorpi non era chiaramente correlato con i risultati clinici (Ren 2020).

In alcuni pazienti, le IgG sono trovate anche più velocemente delle IgM. In uno studio sui modelli di sieroconversione degli anticorpi IgM e IgG, il tempo di sieroconversione dell’anticorpo IgG era minore di quello dell’IgM. L’anticorpo IgG ha raggiunto la massima concentrazione il giorno 30, mentre l’anticorpo IgM ha raggiunto il picco il giorno 18, ma poi ha iniziato a diminuire (Qu J 2020). Il più grande studio fino ad oggi ha riportato risposte anticorpali acute in 285 pazienti (per lo più non gravi COVID-19). Entro 19 giorni dall’insorgenza dei sintomi, il 100% dei pazienti è risultato positivo alle IgG antivirali. La sieroconversione per IgG e IgM si è verificata simultaneamente o in sequenza. Entrambi i titoli di IgG e IgM sono risultati positivi entro 6 giorni dalla sieroconversione. Il giorno mediano di sieroconversione per entrambe le IgG e IgM è stato di 13 giorni dopo l’insorgenza del sintomo. Non è stata riscontrata alcuna associazione tra i livelli di IgG di plateau e le caratteristiche cliniche (Long 2020). In una coorte di 30,082 individui infetti con sintomi COVID-19 da lievi a moderati, sottoposti a screening presso il Mount Sinai Health System di New York City per determinare la robustezza e la longevità della risposta anticorpale anti-SARS-CoV-2, i titoli anticorpali neutralizzanti contro la proteina del picco SARS-CoV-2 persistevano per almeno 5 mesi dopo l’infezione. Gli autori prevedono di seguire questa coorte per un periodo di tempo più lungo (Wajnberg 2020).

Tuttavia, vi sono prove che gli individui asintomatici sviluppano risposte anticorpali meno forti. Inoltre, gli anticorpi scompaiono dal sangue. Rispetto ai pazienti sintomatici, 37 pazienti asintomatici avevano livelli di IgG specifici per il virus più bassi nella fase acuta (Long Q 2020). I livelli di IgG e gli anticorpi neutralizzanti hanno iniziato a diminuire entro 2-3 mesi dall’infezione. Da notare che il 40% è diventato sieronegativo (13% del gruppo sintomatico) per le IgG nella fase di convalescenza precoce. Su 19 operatori sanitari che avevano anticorpi anti-SARS-CoV-2 rilevati al basale, solo 8 (42%) avevano anticorpi che persistevano al di sopra della soglia di sieropositività a 60 giorni, mentre 11 (58%) sono diventati sieronegativi (Patel 2020). Una diminuzione del livello di anticorpi anti-RBD è stata osservata anche in 15 donatori di plasma convalescente (Perreault 2020).

Presi insieme, il test degli anticorpi non è solo uno strumento epidemiologico. Può anche aiutare nella diagnosi. Nei prossimi mesi si vedrà come la risposta anticorpale umana al SARS-CoV-2 si evolve nel tempo e come questa risposta e i titoli sono correlati all’immunità. È anche ipotizzabile che in alcuni pazienti (ad esempio quelli con immunodeficienza) la risposta anticorpale rimanga ridotta.

Radiologia

Tomografia computerizzata del torace

La tomografia computerizzata (TC) può svolgere un ruolo sia nella diagnosi che nella valutazione dell’estensione della malattia e nel follow-up. La TAC toracica ha una sensibilità relativamente alta per la diagnosi di COVID-19 (Ai 2020, Fang 2020). Tuttavia, circa la metà dei pazienti può avere una TAC normale durante i primi 1-2 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi (Bernheim 2020). D’altra parte, è diventato chiaro molto presto che una parte considerevole dei pazienti subclinici (scansioni fatte prima dell’insorgenza dei sintomi) può già avere risultati patologici della TC (Chan2020, Shi 2020). In alcuni di questi pazienti che mostravano risultati di TC patologici evidenti per la polmonite, la PCR in tamponi rinofaringei era ancora negativa (Xu 2020). D’altra parte, la metà dei pazienti che in seguito sviluppano una polmonite morfologicamente visibile possono ancora avere una TAC normale nei primi 1-2 giorni dopo la comparsa dei sintomi (Bernheim 2020).

Tuttavia, non si dovrebbe sopravvalutare il valore della TAC toracica. La raccomandazione di alcuni ricercatori cinesi di includerla come parte integrante della diagnosi di COVID-19 ha portato a dure critiche, soprattutto da parte degli esperti dei paesi occidentali. Gli studi cinesi hanno mostrato errori e carenze significative. In considerazione dell’elevato sforzo e anche a causa del rischio di infezione per il personale, molti esperti rifiutano rigorosamente lo screening generale di TAC nei pazienti affetti da SARS-CoV-2 o nei casi sospetti (Hope 2020, Raptis 2020). Secondo la raccomandazione della British Radiology Society, che ha tentato di incorporare la TC negli algoritmi diagnostici per la diagnostica COVID-19, il valore della TC rimane poco chiaro – anche se una PCR è negativa o non disponibile (Nair 2020, Rodrigues 2020). Una TAC toracica dovrebbe essere eseguita solo se si considerano complicazioni o diagnosi differenziali (Raptis 2020).

In studi in cieco, radiologi provenienti dalla Cina e dagli Stati Uniti hanno cercato di differenziare la polmonite COVID-19 da altre polmoniti virali. La specificità era abbastanza alta, la sensibilità è stata più bassa (Bai 2020). Una recente metanalisi ha trovato un’alta sensibilità ma una bassa specificità (Kim 2020). La sensibilità della TC è stata influenzata dalla distribuzione della gravità della malattia, dalla percentuale di pazienti con comorbidità e dalla percentuale di pazienti asintomatici. Nelle aree a bassa prevalenza, la TC toracica ha avuto un basso valore predittivo positivo (1,5-30,7%).

Se patologiche, le immagini mostrano di solito un coinvolgimento bilaterale, con opacità multiple a chiazze o vetro smerigliato (GGO) con distribuzione subpleurale in lobi bilaterali multipli. Le lesioni possono presentare sovrapposizioni significative con quelle del SARS e del MERS (Hosseiny 2020). Secondo una revisione di 45 studi che comprendono 4410 (!) pazienti, le opacità vetrose macinate (GGO), sia isolate (50%) che coesistenti con consolidamenti (44%) nella distribuzione bilaterale e subpleurale, sono state i risultati più diffusi della TAC toracica (Ojha 4410). Un’altra revisione sistematica dei risultati di imaging in 919 pazienti ha trovato GGO multilobari bilaterali con una distribuzione periferica o posteriore, principalmente nei lobi inferiori e meno frequentemente all’interno del lobo medio destro come caratteristica più comune (Salehi 2020). In questa revisione, in un numero minore di casi, soprattutto nella popolazione anziana, è stata riscontrata una presentazione iniziale atipica di immagini di opacità consolidative sovrapposte al GGO. Ispessimento settico, bronchiectasia, ispessimento pleurico e coinvolgimento subpleurico sono stati meno comuni, soprattutto nelle fasi successive della malattia. Il versamento pleurico, il versamento pericardico, la linfoadenopatia, la cavitazione, il segno dell’alone CT e il pneumotorace non erano comuni (Salehi 2020).

L’evoluzione della malattia alla TAC non è ben compresa. Tuttavia, con un tempo più lungo dopo l’insorgenza dei sintomi, i risultati della TC sono più frequenti, tra cui il consolidamento, la malattia bilaterale e periferica, il maggiore coinvolgimento polmonare totale, le opacità lineari, il modello “crazy-paving” e il segno “alone inverso” (Bernheim 2020). Alcuni esperti hanno proposto che la diagnostica per immagini possa essere suddivisa in quattro fasi diverse (Li M 2020). Nella fase iniziale, emergono molteplici piccole ombre frammentarie e cambiamenti interstiziali. Nella fase progressiva, le lesioni aumentano e si allargano, sviluppandosi in GGO multipli e infiltrandosi nel consolidamento di entrambi i polmoni. Nella fase grave, si osservano massicci consolidamenti polmonari e “polmoni bianchi”, ma il versamento pleurico è raro. Nella fase dissipativa, i GGO e i consolidamenti polmonari sono stati completamente assorbiti e le lesioni hanno cominciato a trasformarsi in fibrosi.

In uno studio longitudinale che analizzava 366 TAC seriali in 90 pazienti con polmonite COVID-19, l’entità delle anomalie polmonari è progredita rapidamente e ha raggiunto il suo picco nei giorni di malattia 6-11 (Wang Y 2020). Il modello predominante di anomalie dopo l’insorgenza dei sintomi in questo studio era l’opacità del vetro smerigliato (45-62%). Con il progredire della polmonite, le aree di lesioni si allargano e si sviluppano in consolidazioni diffuse in entrambi i polmoni nel giro di pochi giorni (Guan 2020).

La maggior parte dei pazienti dimessi aveva un residuo di malattia alla TAC finale (Wang Y 2020). Sono necessari studi con un follow-up più lungo per valutare i danni polmonari a lungo termine o permanenti, compresa la fibrosi, come si è visto con le infezioni da SARS e MERS. Si prevede che la fibrosi polmonare sia il fattore principale che porta alla disfunzione polmonare e al declino della qualità della vita nei sopravvissuti di COVID-19 dopo il recupero. Sono necessarie ulteriori ricerche sulla correlazione dei risultati della TC con la gravità e la progressione clinica, sul valore predittivo della TC di base o dei cambiamenti temporali per l’esito della malattia e sulle sequele di lesioni polmonari acute indotte da COVID-19 (Lee 2020).

Da notare che la TAC toracica non è raccomandata in tutti i pazienti di COVID-19, specialmente in quelli che stanno abbastanza bene da poter essere mandati a casa o in quelli con tempi sintomatici brevi (< 2 giorni). Nel caso di COVID-19, un gran numero di pazienti con infezione o sospetta infezione si reca in ospedale. Di conseguenza, il carico di lavoro del reparto di radiologia aumenta notevolmente. Poiché la via di trasmissione di SARS-CoV-2 è attraverso le goccioline respiratorie e la trasmissione a stretto contatto, la TAC non necessaria dovrebbe essere evitata. Una panoramica della prevenzione e del controllo dell’epidemia di COVID-19 nel reparto di radiologia è fornita da An et al.

Ultrasuoni, PET e altre tecniche

Alcuni esperti hanno ipotizzato che l’ecografia polmonare (LUS) possa essere utile, in quanto può consentire l’esecuzione concomitante dell’esame clinico e dell’imaging polmonare al capezzale da parte dello stesso medico (Buonsenso 2020, Soldati 2020). I potenziali vantaggi della LUS includono la portabilità, la valutazione al capezzale, la sicurezza e la possibilità di ripetere l’esame durante il follow-up. L’esperienza maturata soprattutto in Italia con l’ecografia polmonare come strumento al capezzale ha migliorato la valutazione del coinvolgimento polmonare, e può anche ridurre l’uso di radiografie al torace e TAC. Un sistema di punteggio è utilizzato per regione e modello ecografico (Vetrugno 2020). Tuttavia, il ruolo diagnostico e prognostico di LUS in COVID-19 è incerto.

Non è ancora chiaro se vi sia una potenziale utilità clinica di altre tecniche di imaging come la PET/CT 18F-FDG nella diagnosi differenziale di casi complessi (Deng 2020, Qin 2020).

Nei pazienti con sintomi neurologici, la risonanza magnetica cerebrale viene spesso eseguita. In 27 pazienti, il riscontro di imaging più comune è stato quello di anomalie del segnale corticale su immagini FLAIR (37%), accompagnate da una restrizione della diffusione corticale o da un miglioramento leptomeningeo (Kandemirli 2020). Tuttavia, il complesso decorso clinico che comprende comorbidità, lunghe degenze in terapia intensiva con regimi multifarmacologici e disturbi respiratori con episodi di ipossia possono tutti agire come fattori di confusione e sarà difficile stabilire una chiara relazione di causa-effetto tra l’infezione da COVID-19 e i risultati della risonanza magnetica.

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